高压冷冻简介

Tomova, Cveta

June 12, 2013

高压冷冻简介

[Translate to chinese:] Structural details of the C. elegans, head in cross-section. Courtesy of Müller-Reichert T, MPI-CBG, Dresden, Germany, and McDonald K, University of California, Berkeley, USA. Figure-0_17.jpg

水是细胞最主要的组成部分，因此对于维持细胞超微结构至关重要。目前，冷冻固定是固定细胞成分，而不导致其显著结构变化的唯一途径。现阶段有两种常见的方法：投入冷冻与高压冷冻固定。
冷冻固定相较于化学固定有两个明显的优点。它能在毫秒量级内完成固定，并确保同时固定所有的大分子组分。多数蛋白质网络非常不稳定，渗透环境或温度的略微变化就会导致其发生崩解。冷冻固定能够尽可能减少这些不良影响，以便更好地保存生物样品的超微结构，促进对动态过程的研究。目前，高压冷冻是获得较厚玻璃化样品（高达200 µm）的唯一方法。

图1：生长在蓝宝石片上的小鼠胚胎纤维原细胞（由英国布里斯托大学，Verkade P提供）。

介绍

成功的冷冻固定即玻璃化，是将水从液态转化为非晶态，而不产生冰晶。冰晶成核与温度和压力有关（请参见以下图表）。该过程与冷却速率相关，因此冷冻固定是一个时间依赖性过程。冷却速率取决于水的热力学性质、样品厚度以及样品表面的热量流失速率。

Moor和Riehle[1]首先提出了高压冷冻生物样品的构想。于1985年，高压冷冻装置成功商品化。尽管目前高压冷冻仪设计各不相同，但都能以在20 ms内对样品进行同步加压与冷却，并具有很高的重复率。

图2：Kanno等人[2]绘制了水的状态与压力和温度的关系曲线。曲线显示在2,045 bar的压力下，水的熔点降低到251 K，且均相成核的温度降低到181 K。

高压冷冻的新维度

基于Leunissen和Yi[3]发现的自增压快速冷冻原理，徕卡显微系统开发了一种新技术。该技术利用密封样品载具内，液体水在冷却过程中的膨胀趋势，从而在内部产生压力，因而无须使用外部增压系统。这种压力能够在密封样品载体内形成透明且低密度冰。为了达到所需压力（2,010 bar），使冰的熔点降低到251 K（Kanno等人[2]），样品载具内60%的水须转化为低密度冰。

以物理学的视角观察

相较于液态水，低密度冰的形成会导致体积膨胀。数值模拟表明，冻结过程从载体壁向中心发展，该过程会产生强烈弯曲冰锋。制冷剂浸透速度越高，该效应就愈加显著。当冰锋最平坦时，含有低密度冰的部分和充分冷冻或玻璃态的部分之间分离地最好。这可以通过在徕卡EM SPF程序界面内，根据不同样品调整冻结参数来实现。在制冷剂浸透过程中，管内的冰锋始终在致冷剂表面以上，该冰锋的距离取决于浸透速度。

应用——光镜-电镜关联（CLEM）

图3：生长在蓝宝石片上的PtK2细胞的光镜图像：将定位网格固定于细胞上方附近，用于追踪样品。

图4：DIC与荧光图像：当定位到感兴趣细胞时，拍摄DIC与荧光图像（内化EGF-QD655）。叠加图像（右图）显示了细胞中含有EGF-QD655结构的位置。方框区域为细胞内的感兴趣区域。

图5：感兴趣细胞内的荧光量子点：实时跟踪感兴趣细胞内包含荧光量子点的结构，每秒一帧拍摄图像。此处展示了该电影序列中相隔5秒的静止画面。最后一张图像也是该序列的最后一张（因此时间为0秒）。此时，将快速装载器从光镜载物台插入到RTS中，并冷冻样品。

图6：感兴趣细胞的电子显微镜图像（左），放大图（右）：右侧电镜图像为左侧感兴趣细胞中方框区域的放大图。箭头指示在结构内部的量子点。将左图中的“C形”结构与图3的最后一张图像进行比较，可以观察到相似的“C形”结构。这里需要注意的是，电镜图像样品厚度为70 nm，而荧光图像则约为1 μm厚。

由英国布里斯托大学的Verkade P提供。

相关仪器：Leica EM PACT2和Leica EM RTS

应用——冷冻电子显微镜玻璃化切片（CEMOVIS）

切片样品是用Leica HPM100，在铜管中冷冻的酵母细胞制备的。将细胞团与pH 6.5 MES/葡聚糖缓冲液混合，使得最终 MES 浓度为50 mM，葡聚糖浓度为20%。

样品在配置有微操作器的Leica EM UC7/EM FC7冷冻超薄切片机上，在-140℃下，制备50 nm厚切片，并将切片收集于琼脂膜载网上。

使用配有4 K Gatan CCD照相机的Tecnai Polara 300KeV（荷兰FEI公司）电子透射显微镜对切片成像。图像放大倍率为23 K，在成像时，采用6 um的散焦距离拍摄断层图像和8 um的散焦距离拍摄投影图像，并采用930 mm的相机长度拍摄衍射图像。左侧的图像是用IMOD软件包（Kremer等人 [4]）的图像处理软件，对FEI软件采集的10张断层图像进行重构的结果。