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显微镜中的荧光

Transgenic Mouse Embryo, GFP Transgenic_Mouse_Embryo_GFP.jpg

荧光显微技术是一种特殊的光学显微镜技术。它利用的是荧光色素在一定波长的光激发下发光的能力。通过抗体染色或荧光蛋白标记,可以用这种荧光色素标记感兴趣的蛋白质。这样就可以确定单分子物种的分布、数量及其在细胞内的定位。此外,还可以进行共定位和相互作用研究,使用可逆结合染料(如 Ca2+ 和 fura-2)观察离子浓度,以及观察细胞的内吞和外吞过程。如今,利用荧光显微镜甚至可以对亚分辨率颗粒进行成像。

斯托克斯偏移

荧光的一个重要特征是斯托克斯偏移。它描述了激发光子和发射光子的能级差异。荧光色素发出的光子比激发光子的波长更大。这是由于在荧光色素被激发后,但在其发射光子之前向周围释放了能量。由此产生的波长偏移可以区分激发光和发射光。能量的吸收和发射可视为分子物种的具体特征。

荧光显微镜

荧光显微镜(正置光路或倒置光路)与普通的光学显微镜类似,但照明是由激光作为单色光或由汞蒸气灯或氙弧灯等明亮而强大的光源提供的。此外,它还包含一个激发滤光器和一个发射滤光器。激发滤光片只透射能够用特定染料激发试样的光。标本发出的光在到达检测器之前必须通过发射滤光片。发射滤光片只透射波长不同的光,如标本发出的光。

近年来,LED(发光二极管)也被用作荧光显微镜的光源。LED 发出的光的波长取决于生产所用的材料。不过,在大多数情况下都需要一个激发滤光器,因为 LED 发出的光波长范围通常相当宽。

大多数荧光显微镜都是外荧光显微镜。照明器和物镜位于试样的同一侧,光线不会穿过试样。除了激发和发射滤光片外,这种荧光显微镜还需要一个二向色镜。二向色镜允许特定波长的光通过,而其他波长的光则被反射。滤光片和二向色镜通常一起装在一个滤光片立方体中。

激发光穿过激发滤光片,然后照射到分色镜上。二色镜将光线通过物镜反射到试样上。试样中的荧光素被激发并发出光子。发射光通过物镜返回到二色镜。发射光具有适当的波长,可以通过。被试样反射的激发光无法通过二向色镜,会被阻挡。如果激发光能够通过二向色镜,则在到达发射滤光片时会被阻挡。通过发射滤光片的光可以用探测器进行测量。

荧光显微镜使用不同类型的滤光片。可以区分带通滤光片、长通滤光片和短通滤光片。带通滤光片可透过一个波长带,而波长较大或较小的光将被阻挡。长通滤光片和短通滤光片都是边缘滤光片。长通滤波器传输长波长的光。波长超过某一截止值的光将无法通过。相反,短通滤光片可以透过短波长的光,而阻挡长波长的光。

荧光显微镜的不同技术

荧光显微镜应用广泛,特异性强。各种技术可以解决不同的问题,甚至可以避开恩斯特-阿贝(Ernst Abbe)所描述的衍射极限。

分子物种的定位可通过细胞器(如细胞骨架或细胞膜)的共同染色来确定。共焦激光扫描显微镜(CLSM)可以在没有焦平面外部信号的情况下观察样本区域,并可进行光学切片。全内反射(TIRF)显微镜是一种可以观察靠近细胞表面的薄区域的技术。蒸发场可激发该区域的荧光素。

光漂白后荧光恢复(FRAP)是一种观察分子物种动态的技术。限定区域内的荧光团被光漂白,未被光漂白的分子扩散到该区域的情况可以被测量出来。可以利用荧光能量转移(FRET)显微镜进行相互作用研究。激发的供体发色团可将能量转移到受体荧光色团并激发它。这只有当两者非常紧密地结合在一起时才有可能。如果这些染料耦合到不同的蛋白质上,那么只有当蛋白质相互作用时,它们才能传递能量并发出荧光。

亚分辨率成像技术包括受激发射损耗(STED)显微镜、地态损耗(GSD)显微镜、单分子和地态损耗显微镜(GSDIM)以及光激活定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM)。这些技术所使用的亚分辨率显微镜也被称为纳米显微镜,因为它们能分辨纳米尺度的图像。

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