如何对细胞培养进行快速正确的检测

要使细胞处于最佳培养条件且维持活跃增长，有必要更新培养基并定期进行传代培养。可根据细胞类型在对数生长期多次更换培养基。传代培养的最佳时间位于对数生长期和静止期之间，在细胞达到密集状态前进行。

为何需要检查细胞？

每日以及在传代培养前检查细胞培养物非常重要，以此监测细胞健康状况、检查污染情况、确定细胞分离时间。首先用肉眼检查培养基中是否出现真菌污染、培养基浑浊度和颗粒情况，以及通过培养基的颜色变化发现意外的pH值变化。首先用肉眼检查培养基中是否出现真菌污染、培养基浑浊度和颗粒情况，以及通过培养基的颜色变化发现意外的pH值变化。之后应使用倒置显微镜近距离检查细胞整体形态和生长模式。倒置显微镜的光学元件位于样本下方。由于细胞附着在培养皿底部，从底部视角便于观察。由于正常明场照明下难以观察到大多数细胞，因此应在100至200倍的总放大倍数和相差下进行观察[1]。

哺乳类细胞有很多种形态，但培养出的哺乳类细胞大多可分为3类：成纤维细胞【中国仓鼠卵巢（CHO）细胞】、上皮样细胞【人类子宫颈（HeLa）细胞】以及淋巴样细胞【人类白血病（HL60）细胞】。此外，某些细胞系具有特定的形态特征，例如神经细胞（SH-SY5Y）具有很长的树突。细胞形态还受细胞生命周期活动影响。在有丝分裂过程中，许多细胞变得更圆，形成可在培养基中漂浮的高折射性发亮球体。死亡细胞的细胞膜完整性发生变化，细胞变得更圆，贴壁细胞从生长表面分离。在显微镜下，死亡细胞通常不会发亮及产生折射，它们通常的细胞膜形态可能会发生改变。

不同细胞系不仅尺寸和形状不同，生长特性也有所不同。它们要么发展成贴壁细胞（成纤维细胞和上皮细胞），要么发展成悬浮细胞（淋巴样细胞）。大多数贴壁细胞系会生成单细胞层，附着在玻璃或经处理的塑料基板上（例如涂有聚赖氨酸、纤连蛋白、胶原蛋白或明胶）。

如何传代培养细胞？

最常见的传代细胞制备方法是使用胰蛋白酶等蛋白水解酶分解细胞间及细胞与培养基之间的黏合。胰蛋白酶和乙二胺四乙酸的共同作用使细胞从生长表面脱离。胰蛋白酶切断将细胞固定在培养皿上的黏着斑，乙二胺四乙酸则作为钙螯合剂。

根据细胞类型或下游实验也可使用其他蛋白酶代替胰蛋白酶，如天然胶原酶或合成消化鸡尾酒溶液等。

将参与细胞间相互作用的钙粘蛋白中的钙成分去掉，从而分解钙粘蛋白，将细胞分离开来。细胞一旦失去与生长表面和周围细胞的黏合，就能轻易分离并在新的细胞培养皿中生长。细胞一旦失去与生长表面和周围细胞的黏合，就能轻易分离并在新的细胞培养皿中生长。图2描述了传代培养工作流程的基本步骤。在整个传代培养过程中重要的是，要在无污染环境下工作。在传代培养初始阶段、胰蛋白酶分解过程中、细胞计数环节以及细胞分离后都要检查细胞状况。保持正确记录和归档对于获得一致结果和实验追溯同样非常重要。

以下实验计划给出了狗肾脏细胞在90mm有盖培养皿中进行传代培养的基本原则。这些细胞是从狗的远端小管上分离的上皮细胞。在培养过程中，细胞贴壁生长，在实现汇合后形成由多边形细胞构成的单细胞层。

需要以下材料和设备：

材料：

• 培养基预热至 37° C（狗肾脏细胞需要：MEM培养基加5%FCS胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素）；
• 预热不含钙镁的PBS缓冲液；
• 在D-PBS缓冲液中预热0.05%的胰蛋白酶、0.02%的乙二胺四乙酸；
• 台盼蓝（活体染剂）；以及
• 消毒用的70%乙醇或异丙醇。 

当进行无动物源或成分明确的细胞培养时，使用无血清培养基、FBS/FCS合成替代品及非动物性解离剂。

设备：

• 带一次性吸头的细胞计数室移液管或微量移液管；
• 支持相差功能的倒置显微镜（DMi1，Mateo TL）；
• 防护服和材料；
• 温度适宜的水浴槽；
• 37°C、含5% CO2、湿度高的培养箱；
• 离心机；
• 离心管；
• 事先标注的培养皿。

狗肾脏细胞的传代比例应为1:10。根据细胞类型调节比例。例如原代细胞培养物、永生化细胞系、胚胎干细胞等可能具有不同的最佳比例。