显微镜分辨率：概念、因素和计算

数值孔径（NA）与光通过的介质的折射率（n）以及给定物镜的孔径角（α）有关（NA=n × sin α）。显微镜的分辨率不仅取决于物镜的NA，还取决于整个系统的NA，要把显微镜聚光镜的NA也纳入考虑。在显微镜系统中，所有光学元件都正确对齐、具有相对较高的NA值并且相互协调工作，可以分辨出更多的图像细节。分辨率还与标本成像所用的光波长有关；波长越短，可分辨的细节越多，波长越长则分辨细节越少。

在处理分辨率时需要考虑三个数学概念：‘阿贝衍射极限’、‘艾里斑’和‘瑞利判据’。以下按时间顺序逐一介绍。

Ernst Karl Abbe（1840-1905）是一位德国数学家和物理学家。他与Carl Zeiss共同创立了“蔡司光学工作室”即现在的蔡司公司。除此之外，他还在1884年联合创办了Schott Glassworks。Abbe还是定义数值孔径这一术语的首位学者。1873年，Abbe发表了自己的理论和公式对显微镜的衍射极限进行了解释。Abbe发现，标本图像由许多重叠的、多强度且存在衍射极限的点（或艾里斑）所组成。

要提高分辨率（d=λ/2 NA），标本必须使用波长（λ）更短的光来进行观察，或者通过折射率相对高的成像介质来进行观察，又或者使用NA较高的光学组件来进行观察（或者将全部3种因素组合起来）。

但即便将所有这些因素都考虑在内，显微镜系统的极限依然受到限制，因为系统复杂性，波长低于400 nm的光在玻璃中的传播特征，以及整套显微镜需要达到较高的NA。理想光学显微镜的横向分辨率限制在200 nm左右，而轴向分辨率约为500 nm（有关分辨率极限示例，请参见下文）。

将以上全部理论都考虑在内就可以明显看出，在计算分辨率的理论极限时需要考虑很多因素。分辨率还取决于样本性质。我们来看一下使用阿贝衍射极限以及使用瑞利判据进行的分辨率计算。

首先应当要牢记：

NA= n x sin α

式中n为成像介质的折射率，α是物镜孔径角的一半。物镜的最大孔径角大约为144º。该角度一半的正弦为0.95。如果使用油浸物镜且折射率为1.52，则物镜的最大NA为1.45。如果使用‘干式’（无浸没）物镜，则物镜最大NA为0.95（因为空气的折射率为1.0）。

横向（即XY）分辨率的阿贝衍射公式为：

d= λ/2 NA

式中λ 是标本成像所用的光波长。如果使用514 nm的绿光及NA为1.45的油浸物镜，则分辨率的（理论）极限将达到177 nm。

轴向（即Z）分辨率的阿贝衍射公式为：

d= 2 λ/NA2

同样的，如果我们假设通过波长514 nm的光来观察标本且物镜NA数值为1.45，则轴向分辨率为488 nm。

在阿贝衍射极限的基础上，瑞利判据稍稍得到了细化：

R= 1.22 λ/NAobj+NAcond

式中λ为标本成像用的光波长。NAobj 为物镜NA。NAcond为聚光镜NA。‘1.22’是一个常系数。该数值根据Rayleigh的贝塞尔函数研究推导得出。这些主要用于对系统当中的问题，例如波的传递，进行计算。

将聚光镜的NA考虑在内，空气（折射率为1.0）通常是聚光镜和玻片之前的成像介质。假设聚光镜的孔径角为144º，则NAcond数值将等于0.95。

如果使用514 nm的绿光，油浸物镜的NA为1.45，聚光镜的NA为0.95，则分辨率的（理论）极限将达到261 nm。

如上所述，用于对标本成像的光波长越短，可以分辨的细节越多。因此如果使用400 nm的最短可见光波长，油浸物镜NA为1.45，聚光镜NA为0.95，则R等于203 nm。

要在显微镜系统当中达到（理论）分辨率的最大值，每个光学组件都应当具备最高可用的NA（把孔径角纳入考虑）。此外，观察标本所用的光波长越短则分辨率越高。最后，整个显微镜系统都应当准直对齐。