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改善冷冻电子断层扫描工作流程

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改善冷冻电子断层扫描工作流程

3D亚纳米分辨率揭示细胞机制

徕卡显微系统有限公司和赛默飞世尔科技有限公司合作开发了一个整条技术路线的冷冻电子断层扫描工作流程。它确保从通过THUNDER成像仪EM冷冻CLEM(也可选择新版的CORAL Cryo冷冻共聚焦CLEM)预选与我们的EM GP2的玻璃化冷冻到Thermo Scientific Krios™ G3i Cryo TEM的3D图像重建的完全整合。所有仪器之间的无缝通信能够获得可靠的结果和可重现的实验。

受益于样本和数据的安全传输以及易于检索的细胞目标区域。为了进一步优化样本制备过程,请在工作流程开始时添加PRIMO,以控制EM网格上细胞的扩散和位置。研究其亚细胞背景下的复杂生物学机制,并借助THUNDER技术获得亚纳米分辨率图像。

步骤 1:玻璃化

通过使用PRIMO克服cryo-ET样本制备过程的首次挑战,PRIMO是一种微排布系统,允许在EM网格上控制细胞粘附、扩散和形状。它能够实现精确的细胞定位和优化的细胞铺展,同时使EM网格表面不受损坏。该软件自动对齐您在EM网格网格内的排布,确保您的细胞处于最佳位置,以便进一步处理。

通过以下网址了解更多有关PRIMO的信息:https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/

步骤2:玻璃化冷冻

冷冻前,将样品保存在湿度受控的环境室中,温度保持稳定。

然后使用自动快速冷冻机EM GP2通过快速冷冻对样品进行玻璃化冷冻。玻璃化冷冻过程抑制冰晶形成,确保细胞内容物尽可能接近天然状态。

步骤3:选择

为了实现高效的工作流程,必须预选合适的细胞和目标区域。这是通过使用冷冻光学显微镜THUNDER成像仪EM冷冻CLEM​​​​​​实现的。然后将样品转移至Thermo Scientific™ Aquilos™进行研磨。仪器之间的完全平衡性意味着定义的区域和坐标被安全、精确地传输,以便阿奎洛斯立即重新定位。投入时间搜索相关目标位置!

为避免标本污染,一体式冷冻断层扫描工作流程所涉及系统之间样本的安全转移。专用检测盒系统在整个工作中保护您的样本,为您流程的可靠科学结果提供精细的基础。

(Thermo Scientific 、Krios和Aquilos是Thermo Fisher Scientific的商标。)

步骤4:研磨

在THUNDER成像仪EM冷冻CLEM中预选和定位后,将样本转移到Thermo Scientific Aquilos(专用的冷冻双电子束电子显微镜)。

过去,因为许多样品太厚无法通过冷冻电子断层扫描成像,不可能以亚纳米分辨率解析细胞内部。

Aquilos通过使用扫描电子束(SEM)和聚焦离子束(FIB)克服了厚度限制。当电子束用于成像时,一束镓离子确保了玻璃化细胞的精确铣削。

通过铣削过程,创建了薄冰片、网格上片晶,然后可以使用电子断层扫描进行检查。

步骤5:3D冷冻断层扫描

将携带细胞(包括网格片晶)的EM网格从Aquilos转移至Thermo Scientific Krios™G3i(冷冻TEM)。

冷冻TEM通过逐渐倾斜样品,从不同角度对感兴趣区进行多次成像。

对单个图像进行计算对齐和重建,以亚纳米分辨率从片晶及其内容物生成三维断层图像。

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