步骤 1：玻璃化
通过使用PRIMO克服cryo-ET样本制备过程的首次挑战，PRIMO是一种微排布系统，允许在EM网格上控制细胞粘附、扩散和形状。它能够实现精确的细胞定位和优化的细胞铺展，同时使EM网格表面不受损坏。该软件自动对齐您在EM网格网格内的排布，确保您的细胞处于最佳位置，以便进一步处理。
通过以下网址了解更多有关PRIMO的信息：https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/
步骤2：玻璃化冷冻
冷冻前，将样品保存在湿度受控的环境室中，温度保持稳定。
然后使用自动快速冷冻机EM GP2通过快速冷冻对样品进行玻璃化冷冻。玻璃化冷冻过程抑制冰晶形成，确保细胞内容物尽可能接近天然状态。
步骤3：选择
为了实现高效的工作流程，必须预选合适的细胞和目标区域。这是通过使用冷冻光学显微镜THUNDER成像仪EM冷冻CLEM实现的。然后将样品转移至Thermo Scientific™ Aquilos™进行研磨。仪器之间的完全平衡性意味着定义的区域和坐标被安全、精确地传输，以便阿奎洛斯立即重新定位。投入时间搜索相关目标位置！
为避免标本污染，一体式冷冻断层扫描工作流程所涉及系统之间样本的安全转移。专用检测盒系统在整个工作中保护您的样本，为您流程的可靠科学结果提供精细的基础。
（Thermo Scientific 、Krios和Aquilos是Thermo Fisher Scientific的商标。）
步骤4：研磨
在THUNDER成像仪EM冷冻CLEM中预选和定位后，将样本转移到Thermo Scientific Aquilos（专用的冷冻双电子束电子显微镜）。
过去，因为许多样品太厚无法通过冷冻电子断层扫描成像，不可能以亚纳米分辨率解析细胞内部。
Aquilos通过使用扫描电子束（SEM）和聚焦离子束（FIB）克服了厚度限制。当电子束用于成像时，一束镓离子确保了玻璃化细胞的精确铣削。
通过铣削过程，创建了薄冰片、网格上片晶，然后可以使用电子断层扫描进行检查。
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