活细胞成像指南

活细胞成像包括捕捉活细胞、有机体、组织或整个生物体的图像。图像可以是静态或延时序列。随着光学、电子学和荧光标签技术的进步，这种技术的应用也在不断扩大，使其更加便捷和强大。活细胞成像的两大优势使其成为现代生物研究的关键：

• 观察细胞时不会出现固定引起的假象，以及
• 实时监控动态细胞过程。

捕捉钙信号或线粒体变化等快速生理事件需要较高的帧频，有时甚至需要每帧几毫秒。要确保取得有意义的结果，保持细胞健康至关重要。

• 培养基 哺乳动物细胞培养需要温度和 pH 值控制、缓冲（CO2 或 HEPES）以及营养和血清。
• 培养容器：图像质量取决于容器，其中玻璃底和包被的更受青睐。
• 无菌技术：保持无菌对细胞培养至关重要，尤其是在无抗生素方案方面。
• pH 值调节： 使用化学缓冲液或二氧化碳缓冲液以及专门的培养室来控制 pH 值。
• 光毒性在荧光成像过程中，通过使用灵敏度高的照相机和低强度照明，可最大限度地减少光照射，从而防止细胞受损。
• 焦点漂移：在长期成像过程中，可通过热稳定性、专用硬件和自动对焦进行管理。

活细胞基本上是无色的。有些实验装置不允许对比染料和标签。在这种情况下，显微镜技术会利用反射、双折射、光散射和衍射等现象来获得最佳对比度。

• 相差显微镜它将相位变化转化为图像对比度。适用于对薄的、活的、未染色的标本进行成像。样品较厚时容易产生光晕伪影。
• 微分干涉对比（DIC）显微镜：DIC 使用偏振光和折射率差异来生成未染色生物样本的阴影高分辨率图像，但仅限于玻璃容器。
• 集成或霍夫曼调制对比度（IMC 或 HMC）：它利用分区振幅滤波器将相位梯度转换为亮度差，从而生成伪三维图像。IMC/HMC 与塑料容器兼容。

荧光是一种发光形式。它通常与显微镜一起用于：确定细胞中单分子的分布和数量，研究共聚焦和相互作用，以及检查内吞和外吞等过程。荧光团可以附着在抗体上（免疫荧光）、通过基因表达或用作生化传感器。

光操纵利用光来激活、改变或破坏荧光团或细胞结构，用于研究活体标本的过程。

• 佛斯特共振能量转移（FRET）、FLIM-FRET 和生物发光共振能量转移（BRET）：它们测量细胞内蛋白质的相互作用。
• 光漂白后荧光恢复（FRAP）、逆 FRAP（iFRAP）和光漂白中荧光损失（FLIP）：它们利用荧光恢复、反向损耗或跨细胞区的连续损耗来跟踪蛋白质动态。
• 光激活、光转换和光开关：他们操纵荧光团的状态来跟踪蛋白质的定位、动态和表达。
• 光遗传学它使用光敏蛋白来监测细胞信号通路。
• 切割和消融：激光切割或破坏特定的细胞结构，以研究发育、伤口愈合和再生。
• 打开：紫外线可激活 "笼状 "化合物，释放神经递质、离子或核苷酸。

倒置显微镜通常用于活细胞成像。与正置显微镜相比，它具有某些优势：

• 工作距离因为物镜位于载物台下方，所以倒置显微镜的标本和聚光透镜之间距离更大。可实现较大的工作距离。
• 进入细胞培养基：倒置显微镜台上容器上方的空间很容易接近，因此可以从培养基中提取标本或有效地向培养基中添加物质。
• 优化细胞成像：通常情况下，细胞会粘附生长或沉淀在容器和孔的底部。因此，使用倒置显微镜更容易对它们进行成像。目标物污染介质的风险很小或没有。

细胞培养是生物医学研究的基石，有助于细胞生物学、免疫学和癌症研究等领域的研究。细胞按形态（成纤维细胞、上皮样细胞、淋巴母细胞样细胞）、类型（永生细胞、原代细胞或干细胞）和组织结构（二维单层细胞到复杂的3D类器官或芯片上的器官系统）进行分类。培养条件要求 37 °C、无菌环境、营养丰富的培养基以及通过缓冲控制 pH 值。使用相差或荧光等对比技术对细胞培养物进行成像时，倒置显微镜必不可少。先进的设置支持对细胞健康、汇合度和基因表达进行精确监测。借助 iPSC（诱导多能干细胞）和3D培养等技术，一个灵活的系统可实现逼真的疾病建模、药物筛选和个性化医疗。

激光显微切割（LMD）是一种利用聚焦激光束从组织切片中分离单细胞或特定区域的精确技术。它能无污染地采集目标细胞，而不会影响邻近区域，因此非常适合 DNA、RNA 或蛋白质分析等下游应用。这一过程通常包括在显微镜下进行目视识别，然后用激光将所需细胞切割成一个收集装置。这种方法被广泛应用于癌症研究、病理学和基因组学领域，尤其是在分析异质标本时。尽管 LMD 主要用于固定组织，但在某些限制条件下，它也适用于活细胞培养和薄组织。

光学显微镜可对模式生物和3D类器官等复杂生物系统进行详细的生理成像。模式生物，如斑马鱼、果蝇或线虫，是用于研究体内发育和疾病过程的模式生物系统。同时，3D类器官（即干细胞衍生的微型器官）可模仿原生组织的结构和功能。先进的显微镜技术，包括共聚焦显微镜、光片显微镜和荧光显微镜，使研究人员能够以三维方式实时观察细胞的动态、结构和相互作用。这些工具对于揭示神经科学、癌症研究、药物发现和再生医学的机制至关重要，在传统的二维培养和全动物模型之间架起了一座桥梁。

活细胞成像在癌症研究中发挥着重要作用，可实时观察细胞行为。利用荧光和延时拍摄等技术，研究人员可以在细胞水平上跟踪细胞分裂、迁移、侵袭和对疗法的反应。这种能力有助于揭示肿瘤进展、转移和耐药性背后的关键机制。活体成像还能研究癌细胞与其微环境（包括免疫细胞和细胞外基质）之间的动态相互作用。通过使用3D球体或类器官等先进模型，而不是传统的二维培养物，活细胞成像可提供更多与生理相关的见解。总之，它通过揭示癌细胞在各种条件和治疗方法下的行为方式，支持靶向疗法的开发。

优化获取的图像和分析对于活细胞成像至关重要，可提高数据质量和生物洞察力。

• 去卷积它使用数学算法将失焦信息重新分配到原点。可以获得更清晰的图像和更好的 3D 效果。
• Computational Clearing根据特征尺寸和光学参数消除焦外模糊，是一种超越去卷积的实时方法。它可以清晰地观察厚试样。
• 结构照明显微镜（SIM）：SIM 使用栅格产生图案化激励，可提高图像对比度和分辨率。对于活细胞成像来说，光毒性可能是一个问题。
• AI（人工智能）图像分析 利用机器学习功能生成可重复的分割结果和快速的二维到五维可视化。