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微分干涉对比(DIC)显微镜

呈现在明场照明下难以观察到的未染色透明生物样本的结构

Neurons imaged with DIC contrast. Neurons_imaged_in_DIC.jpg

本文阐释了在使用显微镜对未染色透明生物样本进行成像时,微分干涉对比法(DIC)为何是明场照明的绝佳方案。样本的明场图像通常缺乏结构和细节,因为局部区域的光吸收强度几乎没有变化。染色确实会在光线穿过样本后造成强度上的差异,但染色通常有毒。DIC显微镜利用光路长度和相移的梯度变化呈现透明结构。

偏振光下的浮雕状图像

在明场显微镜中,未染色的样本通常并不显眼且缺少细节。实际上,它们只是与入射光产生了交互作用并且发生了肉眼无法看到的相移。染色会导致振幅偏移以及通过光强度差异,但更重要的是这种方法仅适用于死材料。会引起光波振幅变化的标本或其结构称为复振幅型的物体[1]。

微分干涉对比(DIC)显微镜利用光路长度和相移的梯度变化,让研究人员在使用显微镜观察时可以看到相位物体[2]。会在光通过时引起相移的样本或其结构称为相位物体[1]。通过这种方式,就能以足够的对比度和分辨率观察活细胞和生物体。DIC可以产生浮雕效果的图像,样本的结构和特征似乎可以投射出阴影。因为光学断层这些相对较厚的样本的成像没有光晕伪影。

DIC显微镜技术最初由弗朗西斯·史密斯发明于1947年,随后由乔治·诺马斯基在1952年进一步开发出实用的显微镜[2]。

对于DIC显微镜,偏振光仅用于照亮样本。偏振光被分散成两束位于正交偏振平面内的不同光线。这两束光线彼此非常接近。当它们在样品内以不同方式折射或散射时,会发生不同的相移。如果这些光线重新聚合,它们会相互干涉。光线现在发生椭圆形偏振。这种偏振光通过分析仪会变为振幅偏移。通过这种方式可以让波长产生整个波长1/200(使用相机时甚至可以达到1/1000)的相移,从而令整个波长可以看到。

明场视野中的神经元成像。 明场视野中的神经元成像。

图1:利用明场和DIC对比法获取的神经元图像。

光波的振荡

对于非偏振光,光波相对于传播轴在各个方向的振荡。不过,对于线性偏振光,所有光波振荡都具有相同的偏振角度或平面。圆极化是另一种可能的极化类型。光波振荡跟随圆周运动并具有稳定的绝对值,而方向则以恒定的角速度变化。椭圆形偏振光是线性偏振光和圆形偏振光的混合物。

偏振光可以由称为偏振片的材料或设备产生。如果类似的组件用于确定振动平面,则称为分析仪。有吸收偏振片和分光偏振片。

DIC显微镜中的光路

在DIC显微镜中,偏振光通过位于聚光镜前方的偏振片产生。这种偏振光通过DIC棱镜分成两个垂直偏振平面的线性偏振光,而这种DIC棱镜又称为沃拉斯顿棱镜。沃拉斯顿棱镜可以位于聚光镜的平面中。标准的沃拉斯顿棱镜由两个双折射材料的楔块制成,这些楔块均粘合在底座上,并且具有平行于外表面并且相互垂直的光轴。

通过该棱镜的偏振光被剪切成两个具有不同偏转角度的紧密间隔光波:正常波和异常波它们具有垂直的偏振平面,对于这两个波,介质的行为就好像它真的具有两个折射率一样。波前剪切发生在两个棱镜之间,位置就在两者折射率交界处的干涉平面上光波在空间上由剪切角分开对于整个棱镜上的所有适配光波而言,它们的方向和间距完全一致。两道光波之间的空间必须小于显微镜的分辨率极限。

因此,样本被紧密间隔的光波照亮,而这些光波以横向位移的方式进入。如果这两种光波与具有不同折射率或厚度的样品部分发生相互作用,当它们从样本中透射而出时,他们的光路长度会有所不同。光路长度是光路上两点之间的折射率和厚度的乘积。因此,它与光的传输时间和速度有关。由于光路长度与光的传输时间有关,因此两个匹配的光波之间会发生相移。

光波穿过样本后,再通过另一个沃拉斯顿棱镜,将它们重新聚合在一起。此时,它们会相互干涉,形成椭圆形偏振光,然后通过分析仪。只有具有明显偏振平面的光波才能通过,因此,不同的光波会产生不同的振幅。相移转变为振幅偏移,导致所获图像的光强度不同。

对于现代DIC显微镜,沃拉斯顿棱镜经常进行改造。其中一个例子就是诺马斯基棱镜。它同样有两个双折射楔块组成,但只有一个楔块与沃拉斯顿棱镜的楔块相同。另一个楔块经过改造,令光轴处于倾斜位置。这种差异导致干涉平面位于棱镜之外。因此,这种棱镜可以位于物镜光圈平面之外,令DIC显微镜使用起来更加方便。

对于DIC显微镜,相邻对象点位的相移差异有助于成像。样本的细节,如果有折射率或厚度上的梯度变化,就可以实现更加清晰的视觉呈现。由于光束相互垂直偏振,因此通过旋转显微镜载物台可以看到图像的差异。

需要记住的是,在进行DIC显微镜检查时,切勿将样本放在塑料器皿中一起使用,因为塑料这样的聚合物对光具有去偏振作用,并且会扭曲对比度。

图4:非偏振光通过偏振滤光片,发生45°偏振在穿过沃拉斯顿棱镜后,光会被分成垂直的偏振分量,其中一个为0°偏振,另一个为90°偏振。随后,聚光镜会引导光线通过样品。样品由两个具有不同偏振角度的相干平行光线照射。这样基本上会产生两个略微偏移的明场样品图像,一个为0°偏振光图像,另一个为90°偏振光图像。由于光线的不同偏振角度,这些图像不会产生任何相长干涉或相消干涉。每条光线会穿过不同的光路长度,因为其穿过样品的位置可能存在厚度或折射率差异。最后的结果是,一条光线相对于另一条光线出现相移。通过物镜后,垂直偏振光线在135°位置重新聚合成一条偏振光线。根据光路长度的差异,两条光线的干涉现在会产生样本区域的增亮或变暗,使结构看起来在明场照明下几乎不可见。最后,135°偏振滤光器(也称为分析仪)会将未发生任何相移的直接透射光滤除。

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