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集成调制对比度 (IMC)

斜向照明提高了活细胞的可见度

Modulation contrast visualizes transparent, low-contrast specimens. Modulation_contrast_visualizes_transparent_low-contrast_specimens.jpg

霍夫曼调制对比已成为观察未染色、低对比生物标本的标准。其创新的技术实现大大简化了操作,提高了使用的灵活性。将调制器集成到现代倒置显微镜的光束路径中,就可以使用各种明视野或相位物镜,而无需选择少量专用物镜。现在,对比度可通过可自由访问的调制器进行单独修改和优化。

调制对比

调制对比是宽场显微镜中的一种对比增强方法,可将未染色标本和活细胞中的光学梯度或斜度转化为不同的光强度。这种方法由罗伯特-霍夫曼(Robert Hoffman)于 1975 年发明,采用狭缝板进行斜向照明,并使用调制器进行光强调制。由于标本具有三维外观,调制对比在医学和生命科学领域的主要应用是微操作技术,如体外受精中的卵胞浆内单精子注射(ICSI)、克隆和转基因中的原核注射。

光路中的特殊部件

光路中至少有两个特殊部件是调制对比度照明所必需的。为了实现斜向照明,聚光器的前焦平面上需要放置一个狭缝板。其次,在物镜的后焦平面上放置一个调制器。调制器包含三个光密度不同的指定区域:一个透明区域、一个允许 15% 的光线进入的区域和一个允许 1% 的光线进入的区域。根据定义,通过调制器的光称为调制光。

除上述组件外,滑板上通常还有一个包含偏振片的第二狭缝。该偏振片与位于显微镜聚光器顶部的另一个偏振片相结合,可用于控制有效狭缝开口(通过打开 90°(暗)位置)并实现浮雕效果。请注意,试样不位于偏振镜之间,因此可以使用双折射塑料或玻璃容器。不过,偏振镜并不是调制对比度的先决条件。

调制对比将相位梯度转换为亮度梯度

细胞中的许多成分都会通过其固有特性导致透射光的相位发生变化。这些特性可能是特定结构的斜度和陡度、改变折射率变化率的结构或特定结构厚度的简单变化。由于这些特性(如细胞厚度)通常会在一定区域内逐渐发生变化(而不是瞬间发生变化),因此光在该区域内的相位变化也会逐渐发生,从而形成相位梯度。相位梯度会使入射光发生衍射,从而导致光的偏转角度发生变化。

由于调制对比采用的是斜向照明,偏转角度的变化可能会受到很大影响,与非偏转光线相比,光线通过调制器的区域会有所不同。在生成的图像中,斜率、陡度、厚度等方面大致相同的细胞区域将显示为灰色。图像的背景也是如此,因为通过这些同质区域的光线不会因试样中的相位梯度而发生相移,几乎不会偏转。

在调制对比系统中,非偏转光线通过调制器中的区域时,光线允许 15%,从而使细胞和背景的同质区域呈现灰色。当光线通过试样中会引起相移的区域(如细胞膜斜率的变化)时,光线会偏转到调制器的暗区(1% 允许光量)或透明区(100% 允许光量)。当试样被斜向照射时,图像将从梯度的一侧(光线偏转到 1 % 允许区域)显示较暗,而从梯度的另一侧(光线偏转到 100 % 允许区域)显示较亮。

IMC 提供更大的自由度

在集成调制对比(IMC)情况下,调制器集成在物镜之外,位于光束路径中与聚光器(中间瞳孔)共轭的焦平面上(图 4)。调制器安装在滑块上,滑块插入支架侧面的瞳孔间接口(图 5)。因此,用户可以自由地调节对比度。除此之外,还可以使用不同传输方式的调制器。滑块还有一个明视野位置,用于拍摄未经调制的图像。配备 IMC 的显微镜可确保所有物镜的对比度方向(三维印象的阴影方向)相同。因此,在更换物镜或放大倍率时,标本的空间印象保持不变,因此无需调整狭缝光阑。

解除调制器耦合时的一个基本考虑因素是,物镜的后焦平面可以在整个 45 毫米准焦距范围内的任何地方。因此,物镜外的调制器必须至少能移动这个距离。徕卡物镜的设计由固定焦平面、倒置显微镜的部署以及从 5x 到 63x 的固定放大倍率阶梯所决定,因此可以将调制平面的数量减少到两个瞳孔位置(图 6)。

通向瞳孔成像的光束路径,即所谓的中间瞳孔,被设计为 1x 望远镜系统。物镜后的无限光束路径在中间瞳孔中再现。因此,任何厚度的平面平行光学调制器都可以插入中间瞳孔的光束路径中,倾斜或直至倾斜,而不会影响图像的位置或质量。通过望远镜系统的最佳单色和色度校正,以及 IMC 调制器的蒸镀灰色和深色金属涂层的极低反射特性,可以最大限度地减少杂散光和虚假光。

独立可变参数

IMC 为单独调节调制对比度提供了很大的空间。调制器可垂直调节,以便始终提供均匀的图像。因此,可以补偿平台或缓冲溶液水平的变化以及细胞在试样盘中的不同位置。侧向移动调制器可改变分辨率: 调制器和狭缝光阑向外移动得越远,分辨率就越高(最大分辨率 Res = λ\2NA)。

有两个调制器参数会影响对比度的强度:透射率和灰色区域的宽度。降低透射率可增加对比度。例如,25% 的透射率会产生平滑的对比度。当透射率为 10%左右时,对比度会明显变清晰。改变调制器的宽度也同样有效(图 7)。

缩小灰度区域可获得更清晰的对比度,而宽调制器则可柔化整体图像印象。IMC 的狭缝光阑有两个开口。第一个狭缝在调制器的灰色区域成像,产生用于调制对比度的斜照明。第二个狭缝由偏振箔覆盖(图 7)。位于光阑前面的可旋转偏振片可增加或减少调制对比度的三维效果。使用塑料盘时,偏振片不会影响图像质量,因为光线只在照明侧偏振,物镜侧不使用分析器。狭缝光阑的尺寸与最常用的聚光器相匹配。

因此,IMC 不仅适用于生物材料的常规检查,也是微操作、显微注射或显微切割等高要求应用的绝佳工具。

IMC 的优点

集成调制对比技术具有众多优点,因此被广泛应用于宽视场显微镜。集成调制对比度允许使用放大系数高达 63 倍的物镜。无需特殊物镜,高校正物镜(如平面变色物镜和变色物镜)也可用于调制对比。这样就能以良好的对比度和可见度获得极佳的细节分辨率。

调制对比显微镜的另一个优点是,与微分干涉对比显微镜不同,可以使用塑料容器和盘子,因为光路中的偏振器位于样品之前。此外,还无需使用沃拉斯顿棱镜。因此,配备调制对比显微镜的成本适中。

参考文献

Hoffman, R.: The Modulation Contrast Microscope: Principles and Performance, Journal of Microscopy, Vol 110, pt 3, August 1977, pp. 205–222

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