浸没式物镜:使用油、甘油或水来克服分辨率限制

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要用显微镜在高倍镜下检查标本,有许多因素需要考虑。其中包括分辨率、数值孔径(NA)、物镜的工作距离以及物镜前透镜采集图像所用介质的折射率。在这篇文章中,我们将简要地看一下如何在盖玻片和物镜前透镜之间利用浸泡介质帮助提高NA和分辨率。此外,我们还将考虑空气和构成载玻片、盖玻片的玻璃的折射率,以及当光从一种介质传播到另一种介质时,如何使用浸没介质部分地减少错配。此外,文中还提供了使用油浸式物镜的实用技巧以及水浸式物镜的优势,特别是针对活细胞的成像。

浸没液体

光学显微镜所面临的主要问题之一是克服某些光学分辨率的限制并提高系统的NA值。简言之,物镜的NA是指从标本中收集光的能力,而分辨率是指物镜分辨标本中细节的能力。

分辨率和NA将在其他文章中详细说明,我们现在将介绍显微镜专家可用的浸没技术,这种技术可在高倍放大率下对标本进行成像,同时克服分辨率的一些限制。

在物镜前透镜和标本盖玻片之间的空隙中填充浸没液体可提高物镜的分辨率。当光从一种介质传递到另一种介质(例如,通过玻璃到空气)时会发生折射 - 换句话说,光会弯曲并散射。任何折射到空气中的光线、被盖玻片反射的光线或被物镜前透镜的金属外壳实际阻挡的光线都不会对成像产生贡献。浸没液体的目的在于减少光在标本上形成的折射和反射,并提升物镜捕捉这些偏离光的能力(见图1)。

折射率

光线穿过的介质的物理性质决定了光线被折射的程度。“折射率”是一个数值(没有单位),该数值决定了光通过材料时的折射程度。空气的折射率为1.0,而显微镜载玻片和盖玻片的折射率通常为1.5。考虑到这一差异,浸泡液体的目的是匹配(尽可能接近)玻片的折射率,从而增加形成最终图像的光线量。随后,大多数浸油的折射率为1.51。常见折射率见表1。

浸没介质

RI

空气

1.00

1.33

甘油(100%)

1.47

香柏油

1.51

徕卡浸没油(标准和“F”型)

1.51

 

 

玻片

RI

玻片(硼硅酸盐或“Parex”)

1.47

玻片(冕玻璃或钠钙硅玻璃)

1.51

 

 

封片介质

RI

细胞培养基

1.31至1.33

Fluoromount-G™

1.4

ProLong®/ProLong® Gold

1.46

VECTASHIELD®

1.44

VECTASHIELD® Hard+SetTM

1.46

Mowiol®

1.41 – 1.49

均质浸没系统

理想情形是创建所谓的“均质浸没系统”。使用该系统可以获得最大的分辨率和NA。均质浸没系统的目的是匹配(尽可能接近)物镜前透镜、浸没介质、盖玻片/载玻片、封片剂和(原则上)聚光镜透镜的折射率和NA(见图2和表1)。

通常不需要在聚光镜的透镜上使用浸没液体。如果显微镜的设置和校准正确,且在整个样本上获得最佳对比度和照明度(见“关于科勒照明”的文章),则聚光镜将处于最适宜的位置和设置,从而有助于显微镜系统的整体NA。

工作距离

显微镜物镜需要考虑的另一个因素是“工作距离”。这是当样本处于锐聚焦时,物镜前透镜和盖玻片表面之间的实际距离(见图3)。当物镜移到离载玻片更近的位置时,焦平面进一步移向样本中。然而,这在物理上受到限制,因为物镜只有在接触到盖玻片后才能移动。工作距离与每个物镜的放大倍数成反比关系。例如,10倍物镜的工作距离可能为4 mm,而100倍油浸物镜的工作距离通常为130 mm。相比之下,一些水浸/水浇蘸(Water Dipping)物镜的工作距离约为3 mm。工作距离是另一条信息,通常刻在物镜筒上,缩写为“WD”(不要与水镜混淆-见下文)。

浸没油和油浸式物镜

使用油浸物镜时要记住的一个关键因素是使用正确匹配的浸油。只能使用物镜制造商推荐的油。多年来,杉木油是常用于浸没介质(目前仍在市场上出售)。虽然这种油的折射率为1.516,但存在硬化趋势,如果使用后不取出,可能会损坏透镜。此外,这种油会吸收蓝色波长和紫外线,而且老化时会不断变黄。

大多数现代化浸油都是人工合成并经过标准化处理,确保不会损坏透镜或随着老化而变色。要记住的一点是,浸油有一个最佳的工作温度。大多数商用合成油的设计工作温度为23℃,仅1℃的变化将导致折射率变化0.0004。其他浸油可在不同温度下获得最佳性能,但对于大多数用途,显微镜设备应在23℃下保持稳定(这对于共聚焦显微镜等仪器的维护也很重要)。

使用油浸式物镜(见图4)开展荧光显微镜观察时,建议使用特殊的低自体荧光油。很多通用浸油在特定情况下将会发出荧光。大多数用于荧光显微镜的浸油都通过名称/代码之前或之后加上字母“F”来识别。

油浸式物镜的使用

•       从使用低倍物镜查看样本开始,在切片上找到感兴趣的区域。

•       逐步切换至40倍放大率并将显微镜设置科勒照明。

•       通过物镜转盘(物镜的连接底座)在40x和100x物镜之间切换但不要直接接触高倍物镜。

•       从显微镜的一侧看去,小心地将1滴浸油直接滴到盖玻片上。将高倍物镜摆入到位(继续从一侧观察载物台),先粗调然后微调对焦,让物镜前透镜与浸油发生接触。有些油浸物镜的前透镜是凹面的,这意味着还应该在物镜上滴一滴油以防止气泡被困在凹透镜中。

•       然后可以再次通过目镜观察。仅使用微调对焦来调整视野。虽然高倍物镜含有弹簧加载式转换器,但在这个阶段粗聚焦很容易导致盖玻片或载玻片破裂,也可能损坏物镜前透镜。

•       即便您计划观察其他载玻片,也应在此阶段清除物镜上的浸油以防止可能污染显微镜的其他部分。对于不适合浸没的显微镜部件和物镜,浸油会渗透并造成损坏。用镜片清洁纸巾在镜片上擦一次,去除多余的油。每次擦拭都要用干净的纸巾擦拭物镜前透镜,直到没有残留油的痕迹。可使用市售除油溶液或少量二甲苯最终清洁透镜。同样,在对透镜应用任何溶液之前,请务必仔细了解物镜制造商的建议。

水浸式物镜

在研究级显微镜(通常是共聚焦显微镜)上有一种不太常见的浸没式物镜是“水浸”物镜,通常在物镜筒上缩写为“WI”或“W”。当对细胞培养基中的活细胞成像时,强烈建议使用水浸式物镜。有两种类型的水浸式物镜(见图5)-“水浸”和“水浇蘸”(物镜筒上通常缩写为“WD”,不要与“工作距离”混淆)。

水浸式物镜通常与正置显微镜配置一起使用,用于直接浸入水或水基介质/缓冲液中。水浇蘸物镜则可提供很长的工作距离。这种物镜在生产时还配有十分曲折的弯角转盘,使用惰性材料如陶瓷等制作而成。水浸物镜的使用方式与油浸物镜类似,但要用水代替油。

使用水浸式物镜的优点之一是简单地将水作为浸没介质。很明显,这种介质很容易清洗。此外,您不需要根据正在进行的成像使用特定的浸没油,也不需要使用显微镜和物镜制造商指定的浸没介质。但使用水浸式物镜时有一些缺点。与水性物镜相比,油浸物镜具有更高的分辨率。此外,由于水的粘度(与油相比),使用水浸式物镜容易受到振动和小空气运动的影响。这种问题可以通过确保显微镜放置在防振台上来克服。或者,更简单的解决方案是在切片上放置一个特殊的环来形成一个小水池。水浸式物镜的最后一个缺点是成本。一些水浸式物镜的成本相当于一套完整的研究级显微镜。

徕卡提供的水浸显微镜自动加水装置克服了长时间活细胞成像或筛查实验中出现水蒸发的潜在问题(见图6)。

总体来看,水浸式物镜的主要优点在活细胞和组织成像时就能体现出来。这主要是因为油浸式物镜不适合活细胞显微镜检查中的细胞或组织间室成像。

活细胞成像

活细胞通常置于细胞间室并且会被细胞培养基(或缓冲液)所覆盖。间室(和培养基)有助于确保细胞或组织在成像的同时处于稳定的环境内。因此,到小室盖片的最佳焦距将变得比较大,这使得工作距离较短的油浸式物镜不适合通过盖玻片/间室、培养基/缓冲液对细胞/组织成像。

此外,使用油浸式物镜来观察水性培养基内的细胞时还会增加额外的折射问题,因为油和水的折射率不同。

观察间室内的活细胞时,光路将遇到不同的折射率。间室/盖玻片的材料和覆盖细胞或组织的水性培养基之间存在不同的折射率。从标本图像中传出的光将在每个阶段发生折射而导致球面像差。

校正环

尽管在水,玻璃或塑料的接触面上通常会发生折射,但水浸式物镜通常可以对此进行校正。此外,一些水浸式物镜装有校正环。可以通过调整环绕物镜的这些校正环适应不同厚度的盖玻片。

徕卡还提供了电动校正环物镜,能够对物镜进行精确的远程调整,以确保在对样本和成像设置造成最小干扰的情况下恢复最佳分辨率(见图7)。

水浸式共聚焦显微镜

最后,水浸式物镜最为适合的应用之一是活细胞的共聚焦成像,因此水浸式物镜通常是许多共焦系统的标配。由于水与油相比粘度较低,使用这些物镜可降低对盖玻片的表面张力,这意味着标本发生移位的可能性较小,尤其是在采集Z轴叠加的过程中。

甘油浸没式物镜

甘油是另一种浸没介质。很多固定样本都使用Mowiol、Vectashield或类似的甘油基封片剂封片(见表1)。这些介质的折射率接近于80/20 甘油/水混合溶液的折射率(RI=1.45)。对于此类封片剂封片标本,甘油物镜(见图8)是最佳选择。

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