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集光:显微镜中数值孔径的重要性

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在试图区分显微镜下观察到的样本细节时,数值孔径(缩写为‘NA’)是一个重要考虑因素。NA是一个没有单位的数,与透镜收集的光角度有关。在计算NA(见下文)时还考虑了介质的折射率,通过将载玻片或细胞培养容器的折射率与浸没介质相匹配就可以分辨出样本的更多细节。光从一种介质传播到另一种介质时的行为方式也与NA有关(称为“折射”)。本文还介绍了折射的简要历史,以及这一概念如何成为实现高NA的限制因素。

显微镜物镜

如果您细看显微镜上的物镜,您会看到镜筒处铭刻有多种不同的信息和数字。除了放大倍数和光学校正外,您还将看到另一组没有单位的数字。这就是物镜上的数值孔径(或‘NA’)(见图1)。

物镜的NA是相对重要并且与图像分辨率相关。简单来说,分辨率是指物镜区分样本细节的能力。没有对应的高NA,高放大倍数的物镜也无法对样本的细节加以分辨。

简单来说,显微镜物镜的NA就是透镜在与所观察物体的固定距离内收集光的能力。光穿过样本时,会以倒锥形进入物镜。但样本中的部分光会出现折射(和反射),这样反过来形成的图像会具有较高的分辨率,并且比具有较低NA的物镜包含更多的细节信息。

孔径角

物镜前透镜收集到的光锥角的最大径向角度又称为‘孔径角’(见图1)。除了增加NA外,图像亮度也与孔径角成正比。孔径角随物镜焦距而变化,它与物镜前透镜在样本聚焦时捕获的从样本发出的成像光线的最大角度有关。

孔径角与物镜焦距成反比。随着焦距的减小,物镜前透镜所能收集的光量也会增加。换言之,如果物镜距离样本很近,那么物镜可以收集到更多的斜射光线。应该说,孔径角通常由物镜内的光学元件决定,每个物镜都有一个最佳焦距。打个比方,想象一下:如果您站在一扇门前,门上有一个钥匙孔可以看到另一个房间,那么当您在远处时只能看到房间里的一点点光和极少的物品。如果您把眼睛凑近钥匙孔,您将会看到房间里更多的细节和光线,因为理论上您增加了眼睛的孔径角。

通过物镜来收集并形成的图像亮度和图像细节(分辨率)与孔径角有关。来自样本的光会连续通过盖玻片与物镜前透镜之间的空气或者穿过浸没介质。

NA的计算

数值孔径可以用下列公式来表达和确定:

数值孔径(NA)= n • sin(α)

在以上公式中,‘n’为盖玻片和物镜前透镜之间的介质折射率(例如空气、水或油)。‘α’符号与光锥角的半角有关并且可通过透镜进行收集(即孔径角;见图2)。

空气的折射率约为1.0,而水的折射率为1.3,用于光学显微镜的一些浸油的折射率可以高达1.52。

折射

要完全理解NA,先理解折射会比较有帮助。在光学和显微镜学当中,折射是指光波穿过样本以及从样本中传来时改变了方向,这是由于光传播经过的介质(例如空气、玻璃、水或油)发生了改变。‘斯涅耳定律’中的公式就很好地对折射进行了描述。Willebrord Snellius(1580-1626)是荷兰数学家和天文学家。他确定出计算地球半径的新方法,还通过数学方法对折射进行了描述并因此名声大噪。但他并不是第一个用数学方式描述折射现象的人,更准确地说,他只是“重新发现”了波斯数学物理学家Ibn Sahl 对于这种现象的描述。Ibn Sahl在984年的手稿中,就阐述了曲面透镜和镜子如何弯曲并聚焦光线。

斯涅耳定律中指出,入射光和折射光的角度之比等于光通过的折射率之比的倒数。

简单地说,当光线从一种介质传播到另一种介质时,它的速度会发生改变 – 例如当光从空气传播到水中时,光的速度会减慢。此外,当光以非90°的角度进入介质时,其速度的变化会导致方向改变。需要注意的是,光的频率不会改变,但是波长将由介质的性质决定。

理论上,物镜前透镜收集的光锥的最大孔径角为180°,α值为90°。由于90度的正弦值为1,因此能够在空气介质中从样本上收集180°合成光的物镜的理论NA值也为1。显然,折射率是实现物镜最高NA的限制因素。因此,高NA物镜都会用浸泡介质代替空气,如油或水。现实中,在样本和物镜前透镜之间有空气的情况下NA值不可能达到1,因此“干透镜”(即非浸没物镜)的最高NA值接近0.95。这是因为大多数透镜无法从样本中收集180°的光,而最宽的角度约为144°。144°的正弦值为0.95而空气的折射率为1.0,因此理论上最大值NA接近0.95。

高倍放大物镜搭配较低的NA最终只能获得较低的分辨率。很多显微镜企业在其物镜当中尽可能将NA提高。所以如果您正在考虑为显微镜购买新的透镜,那就要随时考虑如何在自己的预算范围内购买到NA最高的物镜了。

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