Electron microscope (EM) image of a cross section of C. elegans (roundworm). Courtesy of T. Müller-Reichert, MPI-CBG, Dresden, Germany and K. McDonald, University of California, Berkeley, USA.

高压冷冻简介

Electron microscope (EM) image of a cross section of C. elegans (roundworm). Courtesy of T. Müller-Reichert, MPI-CBG, Dresden, Germany and K. McDonald, University of California, Berkeley, USA. EM_image_of_cross_section_C_elegans.jpg

水是细胞最主要的组成部分，因此对于维持细胞超微结构至关重要。目前，冷冻固定是固定细胞成分，而不导致其显著结构变化的唯一途径。现阶段有两种常见的方法：投入冷冻与高压冷冻固定。
冷冻固定相较于化学固定有两个明显的优点。它能在毫秒量级内完成固定，并确保同时固定所有的大分子组分。多数蛋白质网络非常不稳定，渗透环境或温度的略微变化就会导致其发生崩解。冷冻固定能够尽可能减少这些不良影响，以便更好地保存生物样品的超微结构，促进对动态过程的研究。目前，高压冷冻是获得较厚玻璃化样品（高达200 µm）的唯一方法。

高压冷冻的新维度

基于Leunissen和Yi[3]发现的自增压快速冷冻原理，徕卡显微系统开发了一种新技术。该技术利用密封样品载具内，液体水在冷却过程中的膨胀趋势，从而在内部产生压力，因而无须使用外部增压系统。这种压力能够在密封样品载体内形成透明且低密度冰。为了达到所需压力（2,010 bar），使冰的熔点降低到251 K（Kanno等人[2]），样品载具内60%的水须转化为低密度冰。

以物理学的视角观察

相较于液态水，低密度冰的形成会导致体积膨胀。数值模拟表明，冻结过程从载体壁向中心发展，该过程会产生强烈弯曲冰锋。制冷剂浸透速度越高，该效应就愈加显著。当冰锋最平坦时，含有低密度冰的部分和充分冷冻或玻璃态的部分之间分离地最好。这可以通过在徕卡EM SPF程序界面内，根据不同样品调整冻结参数来实现。在制冷剂浸透过程中，管内的冰锋始终在致冷剂表面以上，该冰锋的距离取决于浸透速度。

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