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如何使用Coral Life(活细胞光电联用)改进活细胞成像

HeLa Kyoto cells (HKF1, H2B-mCherry, alpha Tubulin, mEGFP). Left image: Maximum projection of a z-stack prior to ICC and LVCC. Right image: Maximum projection of a mosaic z-stack after ICC and LVCC. How_to_improve_live_cell_imaging_with_Leica_Nano_Workflow_teaser.jpg

对于活细胞 CLEM 应用而言,光学显微镜成像是在正确的时间以正确的状态识别正确细胞的关键步骤。在本文中,徕卡专家就使用宽场系统的优势以及使用蓝宝石作为细胞培养基底时需要克服的障碍分享了他们的见解。

活细胞成像

对于 Coral Life,已经配置了优化的光学显微镜系统,可以满足活细胞CLEM实验的所有需求:

  1. THUNDER Imager Nano 以倒置显微镜为基础,可进行浸入式成像,而不会有浸入式物镜污染样品的风险。
  2. THUNDER Imager Nano 是一款易于使用的仪器,即使对于非专业人员也能提供高性能的图像数据。
  3. 该系统使用高灵敏度的 sCMOS 荧光摄像机,可以每秒 90 帧的速度捕捉活体事件。因此,您的活细胞 CLEM 实验可从以下优势中获益:
    • 以所需的放大率和分辨率快速获取整个直径 6 毫米蓝宝石基底的概览像素格图像。例如,使用 40x/1.1 NA 物镜可对整个蓝宝石基底进行 468 次曝光。使用 2 个通道(透射光和发射荧光)进行同样的采集大约需要 3 分钟。使用这种方法,用眼睛手动扫描合适的区域就变得不那么重要了。
    • 可以捕捉到快速的细胞事件,以便随后用冷冻电子显微镜进行检查。
  4. 受益于徕卡创新技术 "计算清除",这是THUNDER成像仪系统的一部分。它能有效消除离焦模糊,准确定位感兴趣的蛋白质或细胞结构,以便进行下一步的超微结构分析。

蓝宝石优化成像

为了将活细胞成像与高压冷冻固定结合起来,我们用蓝宝石盘取代了标准玻璃基底,以避免细胞基底在 2000 巴的诱导压力下破裂。对于活细胞光电连用,我们使用直径 6 毫米、厚度 120 微米的蓝宝石盘。遗憾的是,不能使用标准的玻璃校正物镜,因为蓝宝石玻璃在可见光发射范围内会产生 80 纳米的色差。为了优化使用蓝宝石基底的活细胞成像,徕卡显微系统公司开发了一种用于水浸的 40x/1.1 NA 蓝宝石校正物镜。该物镜消除了蓝宝石引起的色差,同时具有与相应玻璃物镜相同的透射性能。此外,该物镜还配有一个电动校正环,用于补偿蓝宝石的厚度变化。

利用 THUNDER技术去除模糊信号

要精确识别和解析目标事件,就必须获得最佳图像质量。遗憾的是,在传统的宽场系统中,可以观察到主要来自焦外区域的背景噪声,这大大降低了对比度和识别感兴趣结构的能力。

为了解决这个问题,徕卡显微系统公司开发了THUNDER技术,能够消除焦外模糊。这项技术可以精确定位感兴趣的结构,以便进行后续的超微结构分析。

尤其是生物样本,背景通常不会在整个宽场图像中保持不变。在整个视野中,背景可能会有很大的变化。计算清除会自动考虑到这一点,使聚焦内的信号立即显现出来。

THUNDER成像仪有三种模式可供选择:

  • 即时计算清除 (ICC)
  • 小容量计算清除 (SVCC)
  • 大容量计算清除 (LVCC)

ICC 相当于上述的计算清除。SVCC 和 LVCC 是计算清除和基于决策掩模的三维解卷积的组合,专门用于薄样本(SVCC)或厚样本(LVCC)。去卷积方法的自适应图像信息提取遵循的是一种从 LIGHTNING(徕卡微系统公司最初为共聚焦显微镜开发的自适应去卷积方法)发展而来的概念。

下面将展示THUNDER技术在使用蓝宝石玻璃作为不同类型样品的基底时的效果。所有样品均使用 40x/1.1 NA 蓝宝石校正水浸物镜成像。第一个样品是 Hela 细胞系,红色突出 DNA,绿色突出微管。任务是跟踪有丝分裂和细胞分裂的不同阶段,分析有丝分裂纺锤体的重建情况。由于固有的背景模糊,对目标结构进行适当的结构分析和识别变得更加困难。应用 THUNDER 和 SVCC 后,背景噪音得以消除,固有的图像信息得以展现。

不仅可以对细胞进行成像和处理,还可以对果蝇或线虫等较厚的组织样本进行成像和处理。下一个示例显示的是用中心粒标记物(绿色)(即中心粒周围物质的蛋白质 SPD-5)标记的秀丽隐杆线虫胚胎。在这里,我们以间期非分裂细胞中的中心粒为靶标。在间期,中心粒-GFP 信号较暗,因此很难从背景中识别和区分。通过使用THUNDER技术,特别是 LVCC,可以消除固有的模糊,获得识别和锁定这些微小、暗淡结构的最佳条件(图 3)。

为了强调 LVCC 对较厚样本的优势,我们对果蝇胚胎进行了研究。用 Ana-2-GFP 标记中心粒,以观察中心粒的同步分裂。目的是在 电镜中创建中心粒分裂的时间表。为实现这一目标,正确跟踪和解析中心粒至关重要。由于蛋壳的荧光背景较高,中心信号不容易被检测到。图像经过 ICC 和 LVCC 处理后,去除了蛋壳的背景荧光并突出中心粒。

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