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宽场显微镜简介

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宽场显微镜是最基本的显微镜技术之一。其根本上是将整个感兴趣的样本暴露于光源下,由观察者或摄像头(也可连接到计算机显示器)获得图像的技术。

本文将阐述宽场(WF)和共聚焦显微镜之间的差异,特别是两种系统之间成像和照明的差异。还将从所涉及的光路以及失焦光问题方面讨论宽场成像的显微镜配置。下文将讨论更先进的宽场技术,例如宽场超分辨率。

宽场与共聚焦显微镜的基本比较

在宽场显微镜中,显微镜载物台上的整个样本将暴露于光源(见图1。最基本的宽场显微镜检查形式是“明场显微镜检查,即从上方(倒置配置)或下方(标准正置显微镜)用白光照射整个样本。

共聚焦激光扫描显微镜中,用于激发荧光染料蛋白质荧光的光源来自激光单元,该单元是整个共聚焦系统的组成部分。共聚焦显微镜检查的主要优势是可选择用户定义的感兴趣区域,而无需将整个样本暴露于荧光光源。另外,共聚焦显微镜可用于通过样本获得的光学切片,其优势在于可排除大部分失焦或背景荧光。

标准宽场显微镜没有共聚焦显微镜复杂,通常包括白色和荧光光源、显微镜和摄像头(有或没有连接的计算机)。在共聚焦系统中,显微镜本身只是配置的一部分,包括激光单元、共聚焦扫描头(包含用于排除失焦光的针孔和用于从样本中收集光子的光电倍增管)和用于控制系统中多个参数以及图像处理的计算机。

比较宽场和共聚焦显微镜的光源

在传统的激光扫描共聚焦显微镜中,可能需要大约五种不同的激光源来覆盖常用荧光团的激发波长。例如,常用激光器为氩离子激光器,其可以产生一系列由滤光片选择的激发波长。氩离子激光器覆盖了激发光谱的绿色波长,并用于激发荧光团,如FITC(异硫氰酸荧光素)。激发光谱的黄色至红色波长被氦-氖激光覆盖,范围为约543632nm。该光谱用于激发荧光团,如德克萨斯红和罗丹明。

在发光二极管(LED)作为宽场显微镜的荧光激发光源引入之前,激发光的主要来源为气弧光灯,这些灯至今仍广泛使用。宽场显微镜中常见的两种弧光灯为汞弧灯(也称为汞燃烧器汞蒸汽灯)和氙弧灯。汞弧灯在大部分可见光谱中提供激发波长(见图2),然而,这种照明不均匀,主峰位于近紫外(UV)波长(313 nm334 nm365 nm405 nm436 nm)内,另外两个峰在546579 nm处的光谱绿色/黄色部分。

与汞弧灯相比,氙弧灯在大部分可见光谱中提供激发波长,但该范围内的峰值不会达到汞燃烧器的强度。尽管与汞燃烧器相比,氙弧灯未扩展到光谱的紫外线部分,但其激发范围进一步进入红外波长。

虽然这些灯为荧光显微镜提供了极强的光源,但其也存在固有问题。这些灯泡的寿命有限,汞燃烧器通常持续200300小时,氙弧灯持续400600小时。由于其使用寿命有限,显微镜应仔细记录使用的小时数(尽管一些系统内置了使用小时数记录器)。如果气弧光灯在其推荐的寿命范围内用完,则存在管爆炸的危险。此外,如果经常接通/关闭灯,会显著缩短灯泡寿命,因此需要考虑这一点。需要仔细处置使用过的弧光灯,并应根据实验室各自的规定进行处置。Leica Science Lab的以下两个教程中介绍了此类灯的更换和对准(见图3):

尽管上文强调了一些缺点,但由于所产生光的强度,汞弧灯仍被视为宽场荧光显微镜的基本光源。

用于显微镜的新一代LED光源不仅提供全光谱的激发波长(约365770 nm),且强度与弧光灯相当。与弧光灯相比,其主要优点是LED光源的寿命可长达50,000小时,无需预热或冷却时段。这也可以节省时间,因为LED单元仅需要在最初安装时进行一次对准调整。最后,废热是弧光灯的一个问题,因此将其安装在显微镜旁边的特殊外壳中。由于LED灯的大部分电气输入转换为光,其实际上不会产生废热。

宽场显微镜的配置

宽场显微镜要么是正置式,从下方照射玻片,要么是倒置式,从上方照射玻片,如图5所示。该配置对待研究的样本有影响。正置显微镜通常用于安装在玻片上的固定样本。倒置显微镜用于观察活细胞。它们通常在液体溶液中生长。只有物镜位于样本下方且聚光器位于样本上方的配置才能保证物镜与样本足够接近。

落射荧光是用于描述荧光显微镜的术语,其中使用相同的透镜(物镜)照射并收集样本发射的光。光从光源发出,穿过滤光片组,穿过双色镜,较短波长激发光通过物镜反射到样本上。来自样本的较长波长发射光通过物镜返回,并穿过双色镜,以在目镜下成像和/或由摄像头采集。

透射照明技术包括相位对比度和微分干涉对比度(DIC)等对比度方法。然而,透射荧光显微镜检查是一种既不为人所知也未广泛使用的方法。该方法不使用双色透镜,而是激光法穿过聚光器和样本,并通过物镜收集发射光。然而,该技术存在许多初始问题,如背景水平高以及聚光器和物镜光学匹配困难[1]。最新进展克服了这些问题,使得透射荧光成像可用于体内成像和牙科研究等区域[2]

宽场显微镜的分辨率

显微镜的分辨率简单理解是区分样本细节的能力。这是样本的两个不同点仍可被视为独立实体的最小距离。有关决定分辨率的概念和因素的更多信息,请阅读此处

与所有传统光学显微镜系统(包括共聚焦)一样,分辨率取决于数值孔径(NA)和光波长。在光学显微镜中,分辨率极限约为200 nm。在具有最高NA光学元件的完全对准显微镜系统中,分辨率极限大约是用于对样本成像的光波长的一半(或激发荧光团)。在将宽场与共聚焦显微镜进行比较时,两种方法中的理论分辨率极限相似。

然而,背景荧光会降低宽场显微镜获得的实际分辨率。如上所述,整个样本在宽场显微镜下照亮,因此焦平面上方和下方的区域也将发出荧光,通过摄像头捕捉并被观察者看到。因此,这种背景荧光会稍微掩盖来自荧光团的发射波长,导致信噪比总体降低,且随后可实现的分辨率和对比度降低。

在共聚焦系统中,(扫描头内的)针孔用于阻挡任何失焦光到达PMT检测器。尽管这具有通过阻挡背景和自动荧光产生清晰聚焦图像的优点,但一些失焦光子可能来自焦平面。这意味着一些信息可能会因针孔而丢失。共聚焦系统上产生的清晰图像与宽场显微镜无意中收集的失焦光之间存在平衡。但是,使用一种称为反卷积的采集后处理方法,可解决模糊和聚焦问题(见图7)。该计算过程可将光子重新分配到其原点。

扩展视场:宽场光漂白后荧光恢复和超分辨率技术简介

光漂白后荧光恢复(FRAP)是一种用于检查分子在一段时间内迁移率的技术。该技术最初用于研究细胞膜中脂质分子的动力学和流动性,但也可用于研究细胞器或细胞质内的蛋白质。在FRAP实验中,荧光探针与感兴趣的分子共价连接,或对靶蛋白进行工程设计以表达荧光团,例如绿色荧光蛋白(GFP)。

一旦定位到感兴趣的荧光团,会对细胞内的目标区域进行有意地(且不可逆地)光漂白以消除所有荧光。随着时间的推移,漂白区域将再次逐渐变为荧光,因为更多标记的靶蛋白会被动(通过扩散)或主动(通过运输)移动到该区域。这些实验可在确定细胞环境内蛋白质实时运动和性质方面产生有用结果(见图8)。

尽管先前使用共聚焦显微镜进行FRAP实验,但现在也有宽场解决方案。与传统的基于共聚焦的FRAP实验相比,宽场光漂白后荧光恢复设备可通过最先进的摄像头提供更快的成像速度,并保护细胞和感兴趣区域免受共聚焦系统引起的过度光应力的影响。

超分辨率显微镜检查技术是那些可在约200 nm的分辨率极限之外成像的技术。近年来已开发了许多超级分辨率技术,包括:

  • 单分子定位技术在该技术中,随着时间的推移,会收集小部分荧光团信号,以建立最终图像。顾名思义,如果实验条件允许,可以捕捉单分子并对其进行成像。
  • 结构照明显微术(SIM)。在该技术中,在宽场光源中构建相位和振幅图案。正在成像的样本也将因此产生类似图案,且所构建的图案与基于样本的图案之间的干涉用于构建细胞内结构。
  • 受激发射损耗(STED)显微术。这种共聚焦技术需要两个激光器,一个用于激发荧光团,另一个圆形激光束用于耗尽来自相同荧光团的发射,从而导致较小的图像捕获区域。

利用宽场显微镜可实现的单分子定位技术之一称为直接随机光学重建显微术(dSTORM)或者也称为基态耗尽,然后是单分子返回显微术(GSDIM)。

GSDIM/dSTORM利用激光器和光可控制开关的荧光探针(可关闭和开启),以随着时间的推移构建图像。大部分荧光探针被诱导进入暗态能级,在该能级其不能发射光子。这使得仅单个且完全分离的荧光团可以以纳米精度定位。

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