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荧光染料

An Overview

荧光显微镜的基本原理是借助荧光染料对细胞成分进行高度特异性的可视化观察。这可能是一种与兴趣蛋白质遗传相关的荧光蛋白,如绿色荧光蛋白(GFP)等。如果克隆无法实现,例如在组织学样本上无法实现,则需要使用另一种技术如免疫荧光染色来对兴趣蛋白质进行可视化观察。为此,人们使用抗体来连接不同的荧光染料并将其直接或间接地结合到适当的靶点上。此外,借助荧光染料,荧光显微镜的应用就不再仅局限于蛋白质观察,还能对核酸、多糖和其他结构进行染色,甚至像钙离子这样的非生物物质也能被检出。本文就为大家介绍了几种常用的荧光染料。

Authors

  • Christoph Greb , Dr.

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免疫荧光

在荧光显微镜下,有两种方法可以显示兴趣蛋白质。可以借助内在的荧光信号,也就是通过克隆从而在基因层面把一个荧光蛋白和一个靶蛋白联系起来;又或者借助荧光标记的抗体特异性结合到兴趣蛋白质上。对于某些生物学问题来说,后者更为实用甚至更为必要。例如,在组织学样本的情况下,通常样本来自不含任何荧光蛋白的生物体,所以不可能使用荧光蛋白。此外,如果有功能性抗体可用,免疫荧光比荧光蛋白技术要快得多,因为荧光蛋白方法必须克隆兴趣基因并将DNA转染到相应细胞中。荧光蛋白的另一个缺点在于其本身就是一种蛋白质。因此细胞内就具备了特定的蛋白质特性,因而可能导致功能紊乱或对所结合的兴趣蛋白产生干扰。当然,值得注意的是,荧光蛋白通常是观察活细胞的首选方法。

免疫荧光利用抗体对抗原的特异性结合亲和力。此处可存在两种不同的结构。最简单的方法是使用一种荧光标记的抗体,该抗体与兴趣蛋白结合,称为直接免疫荧光。

大多数情况下会使用两种形式的抗体。第1抗体与靶蛋白结合,自身(1st抗体)没有荧光标记。但与第1抗体结合的第2抗体(2nd抗体)特异性携带荧光染料,这种方法被称为间接免疫荧光。间接免疫荧光有几个优点,一方面会存在放大效应,因为不止有一种第2抗体与一种第1抗体结合。另一方面,针对您兴趣蛋白,不需要一直用荧光染料标记每种抗体,可以使用市售荧光标记的第2抗体。免疫荧光中广泛使用的荧光染料是FITC、TRITC或以下提到的几种Alexa Fluor®染料。

FITC和TRITC

异硫氰酸荧光素(FITC)是一种有机荧光染料,目前仍用于免疫荧光和流式细胞术当中。该染料在495/517nm处存在激发/发射峰,而且可借助其反应性异硫氰酸酯基团与蛋白质上的氨基、巯基、咪唑基、酪氨酰或羰基结合而与不同的抗体偶联。它的基本结构,即荧光黄的分子量为332g/mol,常用作荧光示踪剂。FITC(389g/mol)是最早用于荧光显微术的染料之一,也是Alexa-fluor488等荧光染料的来源。它的荧光活性源于其自身的大共轭芳香电子结构,在蓝色光谱中会被光所激发。

经常与FITC配合使用的一种染料是同出一门的TRITC(四甲基罗丹明-5-(和6)-异硫氰酸酯)。与FITC不同,TRITC不是荧光素,而是罗丹明系列衍生物。罗丹明也存在一个大的共轭芳香电子结构,因此可以发出荧光。与FITC不一样,TRITC(479g/mol)在绿色光谱中被激发,最大值出现在550nm处,最大发射波长为573nm。与蛋白质(如抗体)的结合也基于反应性异硫氰酸酯基团。

即使FITC和TRITC仍在使用,但考虑到两者属于相当弱的荧光染料,不建议用于最先进的显微术。两者的优势主要还是在于成本低。

花青素

这种相对较小的荧光染料集合源于花青素并因此而得名:Cy2、Cy3、Cy5和Cy7。这些染料都可以通过反应基团与核酸或蛋白质相连。例如,蛋白质标记使用马来酰胺基团。有趣的是,荧光方面Cy5对周围的电子环境很敏感,这可用于酶的测定。黏附蛋白的构象变化导致荧光发射的正负变化。此外,Cy3和Cy5可用于FRET实验。花青素染料是比较古老的荧光染料,也是其它荧光染料的基础,具有亮度高、光稳定性好、量子效率高等优点。

Alexa Fluor®染料

Alexa Fluor®染料是荧光显微镜中常用的一大类带负电荷的亲水性荧光染料。这种染料的命名源于他们的发明家Richard Paul Haugland,他用自己儿子之名Alex Haugland命名了这种染料。标签中的商标为Molecular Probes。此外,在标签中还提到了各染料的激光激发波长。例如,使用非常广泛的Alexa Fluor® 488的最大激发波长为493 nm,方便于标准488 nm激光的激发。Alexa Fluor® 488的最大发射波长为519 nm。Alexa Fluor® 488在这一特性上与FITC有非常相似的性质。虽然Alexa Fluor® 488是荧光黄衍生物,但与FITC相比,它具有更好的稳定性、亮度和较低的pH敏感性。所有Alexa Fluor®荧光染料都是不同基本荧光物质的磺化形式,如荧光素、香豆素、花青素或罗丹明(例如Alexa Fluor® 546、Alexa Fluor® 633)。这些染料的分子量在410到1400g/mol之间。

DNA染色处理

在荧光显微术中,不仅蛋白质结构感兴趣,而且对核酸也感兴趣。有时有必要通过检测细胞核来确定细胞的确切位置或数量。最常见的DNA染色剂之一是DAPI(4',6-二氨基-2-苯基吲哚),主要与DNA双螺旋富含A-T的区域结合。与未结合态相比,DAPI在DNA上的荧光强度增加。染料被UV(紫外线)光激发,最大激发波长为358nm。发射光谱较宽,峰值在461nm。弱荧光也可以检测到RNA结合。在这种情况下,发射转移到500nm。有趣的是,DAPI能够渗透完整的细胞膜。因此,该染料既可用于固定细胞也可用于活细胞。

第二种广泛使用的DNA染色方法是Hoechst染料,最初由化学公司Hoechst AG生产。Hoechst 33258、Hoechst 33342和Hoechst 34580都是邻苯二甲酰亚胺,具有向A-T富集区插入的趋势,因此后者不常使用。与DAPI相似,此类染料受到紫外线激发并在455 nm下发射最大值,在无结合状态下变为510–540 nm。Hoechst染料还具有细胞渗透作用,因此可用于固定细胞和活细胞。与DAPI不同是,Hoechst染料毒性更低。

DNA染色剂碘化丙啶无法透过细胞膜。在细胞培养中,因为该染色剂无法进入完好的细胞内,所以常常被用来区分活细胞和死细胞。碘化丙啶也是一种结合剂,但对不同的碱基没有特异性。在核酸结合态下,其最大激发波长为538nm,最高发射波长为617nm。未结合状态下碘化丙啶的最大激发和发射被移到较短的波长和较弱的强度。它也可以在不改变其荧光特性的情况下与RNA结合。要区分DNA和RNA,必须使用足够的聚合酶。

吖啶橙是一种染料,可以在DNA和RNA之间形成差异区分而无需事先操作。其最大激发/发射对在DNA结合态为502nm/525nm,在RNA结合态为460nm/650nm。此外,该染料还可以进入酸性间室中,如溶酶体。阳离子染料在酸性间室中质子化。在酸性环境中,吖啶橙受蓝色光谱中的光激发,而橙色区域的发射最强。因为凋亡细胞有很多被吞噬的酸性间室,因此也让该染料成为了这类细胞常用的标记物。

间室与细胞器特异性染料

在荧光显微镜下,对细胞间室如溶酶体或核内体和细胞器如线粒体等进行染色通常较为合理。为此,本节将介绍一组特定染料组合。

观察线粒体时一种公认的方法是使用MitoTracker®。这是一种细胞渗透性染料,具有温和的巯基活性氯甲基部分。该染料可以通过与半胱氨酸残基的自由巯基反应,与基质蛋白共价结合。MitoTracker®有不同的颜色和改良成分(见表1),也是Molecular Probes的商标。与传统的线粒体特异性染色剂如罗丹明123或四甲基玫瑰胺不同的是,在用固定剂破坏膜电位后MitoTracker®不会被洗掉。

根据线粒体染色情况,还有染料标记酸性间室如溶酶体等,称为LysoTracker。这些是与荧光团相连的膜渗透性弱碱。由于质子化作用,这些碱很有可能与酸性间室有亲和力。LysoTracker也有不同的颜色(见表1)。

与溶酶体类似的间室为真菌液泡,如酿酒酵母。这种薄膜包围的空间也具有酸性。在荧光显微镜下观察它的方法之一是使用苯乙烯基染料,如FM 4-64®或FM 5-95®。

在蛋白质分泌实验方面,内质网(ER)尤为值得注意。对这种间室进行染色的一种经典染料是DiOC6(3)。这种染料虽然偏向与内质网结合,但也能与线粒体膜等其他膜结合。另一种特定染色ER的方法是使用ER-Tracker,如绿色和红色ER-Tracker。这两种染料都是以BODIPY为基础的染料,与格列本脲(一种磺酰脲酶)有关,能与ER膜上特有的ATP敏感钾通道结合。BODIPY(硼二吡咯甲基)描述了一组相对pH不敏感的染料,这些染料几乎都不溶于水。这类染料并不是很好的蛋白质标记工具,但用于脂质和膜标记时效果较佳。

ER相近间室 – 高尔基体 – 可用荧光神经酰胺类似物如 NBD C6-神经酰胺和BODIPY FL C5-神经酰胺进行标示。神经酰胺是高尔基体中所富含的鞘脂。

在进一步脂质基染料的帮助下还有可能对特殊的膜区域,如脂质筏等进行染色。这些富含胆固醇的结构域可以通过使用NBD-6胆固醇或NBP-12胆固醇等(Avanti极性脂质)来进行可视化观察。

除了使用特殊的非蛋白荧光染料来标记细胞间室外,还可以借助于对细胞中不同位置有偏好的蛋白质来染色兴趣区域。这些蛋白质可以连接到荧光染料上,并在荧光显微镜下显示出来。这种方法的一个例子是小麦胚芽凝集素(WGA)的使用,它与存在于质膜中的唾液酸和N-乙酰氨基葡萄糖基特异结合。WGA与荧光染料偶联。用它可以观察到质膜。

离子成像

在神经元研究中,了解细胞的离子浓度对于基因活动或细胞运动很有意义。钠、钙、氯或镁离子对许多不同的细胞活动有着深刻的影响。通常,借助荧光标记的螯合剂可以捕获离子,当这些螯合剂与适当的离子结合时,就会改变自身的光谱特性。例如,钙指示剂fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4和Calcium-Green(钙绿)就体现了这一原理。

对于钠的检测,通常使用SBFI(钠结合苯并呋喃间苯二甲酸钠)或钠绿。PBFI(钾结合苯并呋喃间苯二甲酸钾)则负责检测钾离子。

值得注意的还有基于蛋白质的钙指示剂,其中之一是基于水母化学发光蛋白。水母发光蛋白、发光基团腔肠素、分子氧和Ca2+的相互作用导致蓝光释放,这是发现荧光蛋白的一个极为突出的机制。

荧光染料及其激发和发射波长峰值

以上提到的全部染料都在下表中列出。此外,表中还提到了其他荧光染料及其激发和发射的波长峰值。

表1
荧光染料样本示例激发发射
Indo-1, Ca saturated331 nm404 nm
Indo-1 Ca2+346 nm404 nm
Cascade Blue BSA pH 7.0401 nm419 nm
Cascade Blue398 nm420 nm
LysoTracker Blue373 nm421 nm
Alexa 405401 nm421 nm
LysoSensor Blue pH 5.0374 nm424 nm
LysoSensor Blue374 nm424 nm
DyLight 405399 nm434 nm
DyLight 350332 nm435 nm
BFP(蓝色荧光蛋白)380 nm439 nm
Alexa 350343 nm441 nm
7-氨基-4-甲基香豆素pH 7.0346 nm442 nm
氨基香豆素345 nm442 nm
AMCA共轭物347 nm444 nm
香豆素360 nm447 nm
7-羟基-4-甲基香豆素360 nm447 nm
7-羟基-4-甲基香豆素pH 9.0361 nm448 nm
6.8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素pH 9.0358 nm450 nm
Hoechst 33342352 nm455 nm
Pacific Blue404 nm455 nm
Hoechst 33258352 nm455 nm
Hoechst 33258-DNA352 nm455 nm
Pacific Blue抗体共轭物pH 8.0404 nm455 nm
PO-PRO-1434 nm457 nm
PO-PRO-1-DNA435 nm457 nm
POPO-1433 nm457 nm
POPO-1-DNA433 nm458 nm
DAPI-DNA359 nm461 nm
DAPI358 nm463 nm
Marina Blue362 nm464 nm
SYTOX Blue-DNA445 nm470 nm
CFP(青色荧光蛋白)434 nm474 nm
eCFP(增强型青色荧光蛋白)437 nm476 nm
1-苯胺邻苯二甲酸-8-磺酸(1,8-ANS)375 nm479 nm
Indo-1, Ca free346 nm479 nm
1,8-ANS(1-苯胺邻苯二甲酸-8-磺酸)375 nm480 nm
BO-PRO-1-DNA462 nm482 nm
BOPRO-1462 nm482 nm
BOBO-1-DNA461 nm484 nm
SYTO 45-DNA451 nm486 nm
evoglow-Pp1448 nm495 nm
evoglow-Bs1448 nm496 nm
evoglow-Bs2448 nm496 nm
Auramine O431 nm501 nm
DiO487 nm501 nm
LysoSensor Green pH 5.0447 nm502 nm
Cy 2489 nm503 nm
LysoSensor Green447 nm504 nm
Fura-2, high Ca336 nm504 nm
Fura-2 Ca2+sup>336 nm505 nm
SYTO 13-DNA488 nm506 nm
YO-PRO-1-DNA491 nm507 nm
YOYO-1-DNA491 nm509 nm
eGFP(增强型青色荧光蛋白)488 nm509 nm
LysoTracker Green503 nm509 nm
GFP (S65T)489 nm509 nm
BODIPY FL, MeOH502 nm511 nm
Sapphire396 nm511 nm
BODIPY FL共轭物503 nm512 nm
MitoTracker Green490 nm512 nm
MitoTracker Green FM, MeOH490 nm512 nm
荧光素0.1 M NaOH493 nm513 nm
钙黄绿素pH 9.0494 nm514 nm
荧光素pH 9.0490 nm514 nm
钙黄绿素493 nm514 nm
Fura-2, no Ca367 nm515 nm
Fluo-4494 nm516 nm
FDA495 nm517 nm
DTAF495 nm517 nm
荧光素495 nm517 nm
荧光素抗体共轭物 pH 8.0493 nm517 nm
CFDA495 nm517 nm
FITC495 nm517 nm
Alexa Fluor 488肼类-水493 nm518 nm
DyLight 488493 nm518 nm
5-FAM pH 9.0492 nm518 nm
FITC抗体共轭物pH 8.0495 nm519 nm
Alexa 488493 nm520 nm
罗丹明110497 nm520 nm
罗丹明110 pH 7.0497 nm520 nm
吖啶橙431 nm520 nm
Alexa Fluor 488抗体共轭物 pH 8.0499 nm520 nm
BCECF pH 5.5485 nm521 nm
PicoGreendsDNA量化试剂502 nm522 nm
SYBR Green I498 nm522 nm
罗丹明Green pH 7.0497 nm523 nm
CyQUANT GR-DNA502 nm523 nm
NeuroTrace 500/525,绿色荧光 Nissl染色-RNA497 nm524 nm
DansylCadaverine335 nm524 nm
Rhodol Green抗体共轭物 pH 8.0499 nm524 nm
Fluoro-Emerald495 nm524 nm
Nissl497 nm524 nm
荧光素葡聚糖pH 8.0501 nm524 nm
罗丹明绿色497 nm524 nm
5-(和-6)-羧基-2',7'-二氯荧光素pH 9.0504 nm525 nm
DansylCadaverine, MeOH335 nm526 nm
eYFP (增强型黄色荧光蛋白)514 nm526 nm
Oregon Green 488498 nm526 nm
Oregon Green 488抗体共轭物 pH 8.0498 nm526 nm
Fluo-3506 nm527 nm
BCECF pH 9.0501 nm527 nm
SBFI-Na+336 nm527 nm
Fluo-3 Ca2+506 nm527 nm
罗丹明123, MeOH507 nm529 nm
FlAsH509 nm529 nm
钙绿-1 Ca2+506 nm529 nm
镁绿507 nm530 nm
DM-NERF pH 4.0493 nm530 nm
钙绿506 nm530 nm
柠檬黄515 nm530 nm
LysoSensor Yellow pH 9.0335 nm530 nm
TO-PRO-1-DNA515 nm531 nm
镁绿Mg2+507 nm531 nm
钠绿Na+507 nm531 nm
TOTO-1-DNA514 nm531 nm
Oregon Green 514512 nm532 nm
Oregon Green 514抗体共轭物 pH 8.0513 nm533 nm
NBD-X466 nm534 nm
DM-NERF pH 7.0509 nm537 nm
NBD-X, MeOH467 nm538 nm
CI-NERF pH 6.0513 nm538 nm
Alexa 430431 nm540 nm
Alexa Fluor 430抗体共轭物 pH 7.2431 nm540 nm
CI-NERF pH 2.5504 nm541 nm
Lucifer Yellow, CH428 nm542 nm
LysoSensor Yellow pH 3.0389 nm542 nm
6-TET, SE pH 9.0521 nm542 nm
Eosin抗体共轭物 pH 8.0525 nm546 nm
Eosin524 nm546 nm
6-Carboxy罗丹明6G pH 7.0526 nm547 nm
6-Carboxy罗丹明6G, hydrochloride525 nm547 nm
Bodipy R6G SE528 nm547 nm
BODIPY R6G, MeOH528 nm547 nm
6 JOE520 nm548 nm
Cascade Yellow抗体共轭物 pH 8.0399 nm549 nm
Cascade Yellow399 nm549 nm
mBanana540 nm553 nm
Alexa Fluor 532抗体共轭物 pH 7.2528 nm553 nm
Alexa 532528 nm553 nm
Erythrosin-5-isothiocyanate pH 9.0533 nm554 nm
6-HEX, SE pH 9.0534 nm559 nm
mOrange548 nm562 nm
mHoneydew478 nm562 nm
Cy 3549 nm562 nm
罗丹明B543 nm565 nm
DiI551 nm565 nm
5-TAMRA-MeOH543 nm567 nm
Alexa 555553 nm568 nm
Alexa Fluor 555抗体共轭物 pH 7.2553 nm568 nm
DyLight 549555 nm569 nm
BODIPY TMR-X, SE544 nm570 nm
BODIPY TMR-X, MeOH544 nm570 nm
PO-PRO-3-DNA539 nm571 nm
PO-PRO-3539 nm571 nm
罗丹明551 nm573 nm
Bodipy TMR-X conjugate544 nm573 nm
POPO-3533 nm573 nm
Alexa 546562 nm573 nm
BODIPY TMR-X抗体共轭物 pH 7.2544 nm573 nm
Calcium Orange Ca2+549 nm573 nm
TRITC550 nm573 nm
Calcium Orange549 nm574 nm
罗丹明鬼笔环肽 pH 7.0558 nm575 nm
MitoTracker Orange551 nm575 nm
MitoTracker Orange, MeOH551 nm575 nm
藻红蛋白565 nm575 nm
镁橙550 nm575 nm
R-藻红蛋白pH 7.5565 nm576 nm
5-TAMRA pH 7.0553 nm576 nm
5-TAMRA549 nm577 nm
Rhod-2552 nm577 nm
FM 1-43472 nm578 nm
Rhod-2 Ca2+553 nm578 nm
四甲罗丹明抗体共轭物 pH 8.0552 nm578 nm
FM 1-43 lipid473 nm579 nm
LOLO-1-DNA568 nm580 nm
dTomato554 nm581 nm
DsRed563 nm581 nm
Dapoxyl (2-aminoethyl) sulfonamide372 nm582 nm
四甲罗丹明dextran pH 7.0555 nm582 nm
Fluor-Ruby554 nm582 nm
Resorufin571 nm584 nm
Resorufin pH 9.0571 nm584 nm
mTangerine568 nm585 nm
LysoTracker Red578 nm589 nm
Lissamine罗丹明572 nm590 nm
Cy 3.5578 nm591 nm
罗丹明Red-X抗体共轭物 pH 8.0573 nm591 nm
Sulfo罗丹明101, EtOH578 nm593 nm
JC-1 pH 8.2593 nm595 nm
JC-1592 nm595 nm
mStrawberry575 nm596 nm
MitoTracker Red578 nm599 nm
MitoTracker Red, MeOH578 nm599 nm
X-Rhod-1 Ca2+580 nm602 nm
Alexa Fluor 568抗体共轭物 pH 7.2579 nm603 nm
Alexa 568576 nm603 nm
5-ROX pH 7.0578 nm604 nm
5-ROX(5-羟基-X-罗丹明,三乙基铵盐)578 nm604 nm
BO-PRO-3-DNA574 nm604 nm
BOPRO-3574 nm604 nm
BOBO-3-DNA570 nm605 nm
溴化乙锭524 nm605 nm
ReAsH597 nm608 nm
钙深红589 nm608 nm
钙深红Ca2+590 nm608 nm
mRFP585 nm608 nm
mCherry587 nm610 nm
Texas Red-X抗体共轭物 pH 7.2596 nm613 nm
HcRed590 nm614 nm
DyLight 594592 nm616 nm
乙二胺同二聚体-1-DNA528 nm617 nm
乙二胺同二聚体528 nm617 nm
碘化丙啶538 nm617 nm
SYPRO Ruby467 nm618 nm
碘化丙啶-DNA538 nm619 nm
Alexa 594590 nm619 nm
BODIPY TR-X, SE588 nm621 nm
BODIPY TR-X, MeOH588 nm621 nm
BODIPY TR-X 鬼笔环肽pH 7.0590 nm621 nm
YO-PRO-3-DNA613 nm629 nm
Di-8 ANEPPS469 nm630 nm
Di-8-ANEPPS-lipid469 nm631 nm
YOYO-3-DNA612 nm631 nm
Nile Red-lipid553 nm636 nm
Nile Red559 nm637 nm
DyLight 633624 nm646 nm
mPlum587 nm649 nm
TO-PRO-3-DNA642 nm657 nm
DDAO pH 9.0648 nm657 nm
Fura Red, high Ca434 nm659 nm
别藻蓝蛋白pH 7.5651 nm660 nm
APC (allophycocyanin)650 nm660 nm
Nile Blue, EtOH631 nm660 nm
TOTO-3-DNA642 nm661 nm
Cy 5646 nm664 nm
BODIPY 650/665-X, MeOH646 nm664 nm
Alexa Fluor 647 R-藻菊酯链霉亲和素pH 7.2569 nm666 nm
DyLight 649652 nm668 nm
Alexa Fluor 647抗体共轭物 pH 7.2653 nm668 nm
Alexa 647653 nm669 nm
Fura Red Ca2+435 nm670 nm
Atto 647644 nm670 nm
Fura Red, low Ca472 nm673 nm
羧萘荧光素pH 10.0600 nm674 nm
Alexa 660664 nm691 nm
Alexa Fluor 660抗体共轭物 pH 7.2663 nm691 nm
Cy 5.5673 nm692 nm
Alexa Fluor 680抗体共轭物 pH 7.2679 nm702 nm
Alexa 680679 nm703 nm
DyLight 680678 nm706 nm
Alexa Fluor 700抗体共轭物 pH 7.2696 nm719 nm
Alexa 700696 nm720 nm
FM 4-64, 2% CHAPS506 nm751 nm
FM 4-64508 nm751 nm

了解更多有关荧光蛋白和染料的信息

  • 荧光蛋白 – 介绍及照片光谱特征
  • 荧光灯式蛋白质和荧光计时器
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