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如何形成清晰的图像

Depth of Field in Microscopy

Object planes of the Greenough stereomicroscope with depth of field range. Object_planes_Greenough_stereomicroscope_with_depth_of_field_range_teaser.jpg

在显微镜检查中,景深常被看做经验参数。在实际操作中,会根据数值孔径、分辨率和放大率之间的相关性确定该参数。为了获得最佳视觉效果,现代显微镜的调节设备在景深和分辨率之间实现了最佳平衡,这两个参数在理论上呈负相关。

this is a change.

人眼景深实际值

DIN/ISO标准将物体侧面的景深定义为“物体平面两侧空间的轴向深度,物在该深度范围内移动时没有可检测到的图像清晰度损失,且图像平面和物镜的位置保持不变”。

然而,该标准没有给出任何关于焦点虚化检测阈值的测量方法。Max Berek是首位就人眼景深发表文章的作者,早在1927年,他就已经将自己通过广泛实验获得的结果公布于世。Berek公式给出了人眼景深的实际值,至今仍在沿用。简化公式如下:

TVIS = n [λ/(2 × NA²) + 340 μm/(NA × MTOT VIS)]

TVIS人眼景深
n物体所处介质的折光率。如果物体移动,则将导致工作距离变化的介质折光率代入等式。
λ:所用光源的波长,如果是白光,λ = 0.55 μm

NA:物体侧面的数值孔径
MTOT
 VIS显微镜的总视角放大率

如果在上述等式中,将总视角放大率替换为有效放大率(MTOT VIS=5001000×NA),可以看出,采用一级近似值时,景深与数值孔径的平方成反比。

放大率低时,缩小光圈(即减小数值孔径)可以显著延长景深。一般可用孔径光阑或共轭平面上的光阑来完成这一操作。但数值孔径越小,横向分辨率越低。

因此,问题在于如何根据物体结构找到分辨率和景深之间的最佳平衡点。借助高分辨率物镜(高NA)和可调孔径光阑,现代光学显微镜能够根据特定样品的要求灵活匹配光学器件。在立体显微镜中,考虑到三维结构中z维度的要求,通常需要作出一些妥协以获得更长景深。

更长的景深

Leica Microsystems采用了一种复杂的光学方法来消除立体显微镜中分辨率和景深之间的相关性,这种方法就是FusionOptics™。该设备提供了一条光路方便观察者单眼观察分辨率高但景深短的图像。另一只眼可通过第二条光路观察到同一物体,但此时分辨率低而景深长。

人脑将两个独立的图像组合成一个最佳的整体图像,即同时具有高分辨率和长景深的特征。

还有一个示例也阐明了人脑的非凡能力,即Greenough立体显微镜。在这个显微镜中,左光路和右光路中的物体平面之间存在微小角度。在整个图像中,整个阴影区域看起来是清晰聚焦的,但左图像或右图像中的并非如此。

数字图像处理中的景深

Leica应用程序组(LAS)的多聚焦模块旨在多次通过多次聚焦来增加自动显微镜的景深。用户可以单独设置照明、图像亮度和所有其他相机参数,以优化所获图像的质量。

利用LAS多聚焦模块,在显微镜和主动对焦的完全一体化控制下,可以轻松捕获具有更长景深的实时图像。z堆栈的自动捕获以及智能图像组合算法确保可以轻松拍摄并存储清晰的聚焦图像。

由于存在自动化处理例行程序,用户几乎无需干预。可针对各种样品轻松更改此类设置。多聚焦模块适用于材料科学、法医学以及生物和地球科学方面的应用程序。

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