荧光寿命成像显微镜（FLIM）的相位分析

Phasor_Analysis_Gattabeads_imaged_with_STED_and_FLIM_Intro.jpg

荧光寿命分析的相量方法无需任何拟合过程。相量FLIM（荧光寿命成像显微术）可提供寿命分布的二维图示。这种图形化显示使观察者能够快速区分并分离FLIM图像中具有不同寿命的组分。相量FLIM分布的解读直观明确。单个像素内即可分辨多种分子物种，因为每种物种均对应一个特定的相量。

相位分析：利用 FLIM 相位差进行分离
图1：左图：用Alexa555-Phalloidin和H2B mCherry标记的细胞。利用FLIM相量进行分离。右图：相量图清晰显示了两个分布。图片由德国康斯坦茨大学生物学系Martin Stöckl博士提供。

如何生成相位图？

等人., 2008).图像中的每个像素对应相位图中的一个点。

相位分析：FLIM 图像与相位图之间的关系
图 2：FLIM 图像与相位图之间的关系示意图。图像中的每个强度像素值在相位图中都有一个对应点。
相量分析：带通用圆的相量图
图3：展示“通用圆”的相量图。图中还显示了任意寿命测量的水平分量（g）和垂直分量（s）。

规则：相量的代数运算

相量方法中仅有少量规则，但它们能够实现对寿命分布的直观解读。以下列出了其中最重要的三条规则（E. Gratton，2018）。

1.单指数寿命位于普遍圆线上。

相位分析：通用圆；单指数寿命
图 4：通用圆线上的单指数寿命

2.多指数寿命在通用圆内，是其单指数寿命成分的线性组合。

相位分析：通用圆；多指数寿命
图 5：通用圆内的多指数寿命。

1和 f2）从它们的两个单指数寿命（τ1和 τ2。

相位分析：通用圆；实验点
图6：通过多指数寿命的线性组合比例确定的两个单指数寿命。

使用相位器的优势

等人, 2007).此外，相位荧光成像与 STED 相结合，可以使用较少的 STED 功率达到相同的分辨率（Lanzanò，2007 年）。 等人~ 2015

相位分析：用 STED 和 FLIM 成像的粒状珠
图 7：左：使用具有 FLIM 功能的 SP8 STED 系统拍摄的 Gattabeads 图像。右图通过在相位图中突出显示长寿命像素，提高了 STED 图像的分辨率。

参考资料和其他信息

  1. M.A. Digman, V.R. Caiolfa, M. Zamai, E. Gratton, The Phasor Approach to Fluorescence Lifetime Imaging Analysis, Biophys.J. (2008) vol. 94, iss.2, pp.
  2. V.R. Caiolfa、M. Zamai、G. Malengo、A. Andolfo、C.D. Madsen、J. Sutin、M.A. Digman、E. Gratton、F. Blasi、N. Sidenius，GPI-锚定 uPAR 的单体-二聚体动力学和分布由细胞表面蛋白组合决定，J. Cell Biol. (2007) vol. 179, iss.5, pp.
  3. E.Hinde, K. Yokomori, K. Gaus, K.M. Hahn, E. Gratton, Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerization, Sci. Rep. (2014), vol. 4, pp.
  4. E.Hinde, M.A. Digman, C. Welch, K.M. Hahn, E. Gratton, Biosensor FRET detection by the phasor approach to fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), Microsc.Res.(2012) vol. 75, iss.3, pp.
  5. L.Albertazzi、D. Arosio、L. Marchetti、F. Ricci、F. Beltram，E0GFP-mCherry 荧光蛋白对的定量 FRET 分析，Photochem.Photobiol.(2009) vol. 85, iss.1, pp.
  6. L.Lanzanò, I. Hernández, M. Castello, E. Gratton, A. Diaspro, G. Vicidomini, Encoding and decoding spatio-temporal information for super-resolution microscopy, Nat.Commun.(2015) vol. 6, p. 6701
  7. L.Wang、B. Chen、W. Yan、Z. Yang、X. Peng、D. Lin、X. Weng、T. Ye、J. Qu，使用相位图方法在低功率下提高 STED 超分辨率显微镜的分辨率。Nanoscale.(2018), vol. 10 iss.34, pp.
  8. J.Sosnik, L. Zheng, C.V. Rackauckas, M. Digman, E. Gratton, Q. Nie, T.F. Schilling, Noise modulation in retinoic acid signaling sharens segmental boundaries of gene expression in the embryonic zebrafish hindbrain, eLife (2016) vol. 5, e14034
  9. E.Gratton, The Phasor approach：应用于 FRET 分析和组织自发荧光，13届2018年荧光动力学研讨会，2018年10月22-26日，美国加州大学欧文分校荧光动力学实验室（LFD），美国
  10. E.Gratton, The Phasor approach：应用于 FRET 分析和组织自发荧光，6届欧洲高级荧光成像与动力学研讨会，2018 年 12 月 10-14 日，德国慕尼黑路德维希-马克西米利安大学 FAB 实验室

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