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荧光寿命成像与荧光共振能量转移

体内生化定量

Donor (D) and acceptor (A) molecule which participate in FRET (Förster resonance energy transfer). Donor_and_acceptor_molecule_which_participate_in_FRET.jpg

荧光寿命是荧光团在发射荧光光子返回基态之前保持其激发态的平均时间长度。这取决于荧光团的分子组成和纳米环境。
FLIM将寿命测量与成像相结合:对每个图像像素以测得的荧光寿命进行颜色编码,产生额外的图像反差。因此,FLIM可以提供关于荧光分子空间分布的信息和有关其生化状态或纳米环境的信息。 FLIM的典型应用是FLIM-FRET。FRET是研究分子相互作用的成熟技术。它能用来研究蛋白质结合并在埃的尺度上估算分子间的距离。

FRET—原理


荧光共振能量转移(FRET)描述了存储在激发的荧光分子(供体)中的能量向其附近的非激发的荧光分子(受体)的非辐射转移。FRET的发生必须满足三个条件:
供体发射光谱与受体激发光谱的重叠(图1)
在纳米(10–9 m)级上分子必须非常接近(图2–4)
分子必须具有适当的相对方位

影响

由于与r-6密切相关(图4),FRET发生在与生化反应高度相关的空间尺度上,例如蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA相互作用。FRET可以通过灵敏的荧光读数来探测分子间的相互作用。这能让研究人员在体外和体内研究分子相互作用。通过合适的荧光标记将两个相关的相互作用方连接起来,可以分析双分子相互作用。FRET还允许构建生物探针,通过强烈的构象变化导致的分子内FRET来报告第二信使的浓度或离子强度。
FRET无疑已发展成为细胞生物学、生物物理学和生物医学成像中广泛使用的工具。

使用活细胞记录FLIM图像


如前所述,FRET效率根据发生FRET供体的寿命τquench与未发生FRET的寿命τ的比率计算得出:

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