Alvarez L, Widzgowski B, Ossato G, van den Broek B, Jalink K, Kuschel L, Roberti MJ & Hecht F：
应用说明：SP8 FALCON：实现视频速率共焦 FLIM 的荧光寿命成像新概念
传统光子计数法功能成像的局限性
共聚焦成像目前是生命科学中荧光成像的标准。功能成像超越了对分子种类位置和浓度的传统记录，能够进一步研究分子功能：其与其他生物分子的相互作用以及其活性、构象、分子环境和翻译后 理想情况下，这些信息必须在高时空分辨率下获取。荧光寿命非常适用于报告生物分子的功能状态，因为分子处于激发态的时间高度依赖于其周围环境及与其他邻近物种的相互作用。由于寿命信息与荧光染料浓度无关，因此它是功能成像的首选方法。然而，多个因素限制了FLIM的广泛应用。首先，传统的时间相关单光子计数（TCSPC）方案本质上较慢且实施困难，尤其对于复杂的成像流程而言更是如此。因此，迄今为止FLIM成像仅限于专业实验室使用，并且即使具备 专业知识，传统TCSPC也无法满足发生在数十秒以下时间尺度的生物学过程对速度的要求。
多检测器采集和全面的光谱灵活性
为克服速度和实验复杂性方面的限制，我们开发了一种创新的寿命测量概念（图1a）。SP8 FALCON上的FLIM方法基于配备现场可编程门阵列（FPGA）电子元件、脉冲激光激发和快速光谱单光子计数探测器的共聚焦扫描头。激光脉冲和来自每个探测器的光子 到达脉冲信号均以97 ps的时间分辨率进行高速数字化处理。数据以比特流形式传输，并由FPGA控制的模式识别算法进行分析。该步骤通过检测脉冲与激光脉冲到达时间之间的差值来确定光子到达时间。通过测量激光脉冲到探测器脉冲之间的时间差，避免了抖动伪影。这些步骤直接在系统电子设备中完成，确保了最高速度并保留了信号质量。随后，数据被传输至计算机，用于生成图像、根据总光子到达时间构建衰减曲线，并计算荧光寿命。这些从检测与激发脉冲到达时间差中直接测得的数据在线实时呈现为“快速FLIM”图像。
传统TCSPC的速度限制源于较长的电子器件和/或探测器死时间，导致系统无法跟上现代共聚焦成像中典型的光子通量。为了避免因所谓的堆积效应导致寿命低估，传统TCSPC系统通常在每激光脉冲0.01至0.1个光子的光子通量下运行，测量误差约为2.5%。此前已有研究描述了针对堆积效应的校正方法。
SP8 FALCON采用了两种互补的方法，可在高光子通量下实现寿命采集。第一种方法是将多个探测器合并使用，并将其视为一个探测器（图1b）。这得益于SP8平台及SP8 FALCON电子系统的全光谱灵活性。光谱灵活性可自由调整探测器的检测范围，以覆盖单一发射光谱，而电子系统则将来自多个探测器的信息处理为如同来自单一探测器的信号。这种探测器叠加方式提高了可处理的光子通量，且该设置可在采集前或分析阶段完成。事实上，SP8 FALCON保留了各个探测器比特流的独立信息 ，因此这些数据可随时合并或单独分析。结合整体系统死时间低于1.5 ns的优势，该多探测器方法可在每脉冲1个光子的通量水平下实现准确的FLIM测量（见图2e详细说明；每个探测器在配合80 MHz脉冲激光使用时最高可达80 Mcps）。第二种方法是引入高速FLIM光子滤波器，以避免堆积效应。该滤波器确保在高光子通量下仍能准确反映整体寿命衰减曲线。
高速 FLIM 过滤器
除高速FLIM滤波器外，我们还引入了两种附加模式以评估数据质量（图2）：“首光子”滤波器和“全光子”模式。“首光子”滤波器（图2a）仅基于每次脉冲后检测到的第一个光子构建荧光衰减曲线。该滤波器模拟传统TCSPC及其固有的堆积效应（图2b），从而导致寿命值的低估。在较高的计数率下，测得的寿命会人为降低（图2e）。“全光子”模式（图2a）则利用所有检测到的光子构建荧光衰减曲线。尽管该模式显著提高了光子统计量，但也引入了一定偏差，若未进行校正，可能导致错误的寿命测量结果（图2e）。然而，“全光子”方法所测得的寿命误差仍小于传统TCSPC。
通过使用高速FLIM滤波器（图2a），我们同时实现了高光子统计量与准确的寿命值测量，且误差最小（图2e）。该滤波器确保仅利用脉冲间单光子事件构建并拟合整体衰减曲线。随后，SP8 FALCON的电子系统与新架构使我们能够直接采用该整体模型及Patting等人提出的公式（公式1）进行逐像素FLIM图像拟合。从而实现：
通过这一双重策略，我们确保采用最佳拟合模型并结合适当的光子统计量（图2c），这对于具有不同光子通量区域的样本尤为有用。为说明这一点，我们对EPAC cAMP FLIM传感器表达水平差异显著的HeLa细胞进行了成像（图2d）。所有细胞的cAMP水平相同，对应约3.5 ns的测量寿命（图2d中黄色像素）。在高光子通量下，“首光子”和“全光子”滤波器均显示出明显的表观寿命误差。而高速FLIM滤波器可在高达每脉冲2.5个光子的通量下准确捕获寿命值。
为量化各滤波器的影响，我们在激光功率递增条件下对罗丹明B溶液进行了寿命测量，每次衰减曲线至少采集100万计数（图2e）。我们最初在每脉冲0.01个光子的通量下进行测量，并将其设定为参考寿命值。这些实验使我们能够直接观察计数率增加对寿命测定准确性的影响。我们注意到，在“首光子”滤波器条件下，在 20-40 Mcps 时，堆积效应已经成为一个重要问题。当采用“全光子”方法时，测得的寿命更接近参考值，但仍偏低。SP8 FALCON上的标准高速FLIM滤波器（图2e中红方块）可在高达225 Mcps的光子通量下稳定测定罗丹明B的寿命，误差范围为0.2%至1.6%。数据表明，SP8 FALCON显著提升了
可用于可靠寿命测量的光子通量范围。
SP8 FALCON的高速FLIM记录功能对于高要求的生物学实验至关重要。例如，它实现了对源自患者活体结直肠癌类器官中ERK活性的时间序列成像监测。ERK信号通路是结直肠癌及其他多种癌症中恶性细胞生长的重要驱动因素，该信号通过改良版EKAREV生物传感器进行记录。
