"Waffle 方法 "
高压冷冻（HPF）已成为低温电子断层成像技术（cryo-ET）的基石，它能以极高的保真度保存原始生物结构，尤其是在厚样本或复杂样本中。为此，通常要在冷冻样品，并所形成的最大200微米玻璃化区域。遗憾的是，玻璃化后的大体积样品，必须在多个维度上进行铣削，以制备样品薄片，然后才能进行电子断层扫描。
近年来有一种样品制备方法越来越流行：Waffle方法"，特别是对于较厚的样品。 这种方法的基础由McDonald等人在2010年奠定，并由Mahamid等人在2015年进一步调整，他们首先使用载网作为HPF铜盘之间的样品载体（图 4）。随后，Kelley等人在2022年的一项研究中正式采用了 "华夫饼法 "这一术语，对该技术进行了标准化，并将其应用扩展到各种生物系统中。
与标准的 HPF 厚样品相比，该技术的优势在于为后续的FIB铣削提供了更小体积的样品。样品被放入载网中，碳膜面朝下。这样，在HPF制备后，栅格内会形成一个玻璃化的 "圆盘"，厚度约为20-30 µm，而不是100-200 µm。因此，样品所需玻璃化冰层深度大大减少。图 1 显示了成功进行HPF制备后，电镜载网上的小鼠海马脑切片荧光图像（Matsui等人，2024年）。
载网骨架可以稳定网格方格中的结构，以便进行FIB铣削，尤其是在获得约200纳米薄片时。在Kelley等人绘制的图2中，我们可以看到隐藏在图像下的载网骨架。在载网骨架上方，有5对明显的沟槽，以便随后对目标薄片进行精细铣削。
兼容载网作为样品载体
“Waffle方法 "是将样品放在由两个抛光铜盘夹着的载网中。EM ICE支持根据试样需要定制铜盘和隔板，从而实现一致的试样厚度和最佳的冷冻几何形状。根据试样的大小，可使用不同的载网类型（网格孔直径从90微米到500微米不等，通常为正方形，也有六边形）。
高通量和可重复性
EM ICE设计用于可重复的冷冻循环，这在制备多个 "Waffle "样品用于高通量低温 FIB 铣削时至关重要。
样品干扰小
该系统可对样品进行温和处理，并快速转移到液氮中，从而降低了机械损伤或蜕变的风险--这在处理精细的载网组件时尤为重要。
与下游低温工作流程集成
EM ICE广泛应用于包括Cryo-FIB/SEM和Cryo-ET在内的工作流程，使其成为 "Waffle方法 "的天然之选，而 "Waffle方法 "依赖于从冷冻到铣削，再到成像的有效工作流程。
使用EM ICE进行 "Waffle方法 "样品制备
最近， Pöge等人 （elifeSciences）将使用 "Waffle方法 "的样品制备技术扩展到 植物组织 。研究人员使用了苔藓、拟南芥和双色柠檬（海熏衣草）的组织。
Schiøtz等人在 《自然-方法》（Nature Methods）杂志上介绍了 "序列提取"（Serial Lift-Out）技术，该技术结合了HPF和高通量Cryo-FIB铣削技术，可从单个样本中提取多个薄片。这样就能对多细胞生物体进行体积取样，例如 C. elegans同时保持大面积组织的完整的超微结构。
在eLife中， Matsui等人 将HPF应用于小鼠脑组织，并将其与低温光电联用技术相结合，研究原生 海马突触 。他们的方法确保了神经回路的快速玻璃化，从而可以在原位对AMPA受体进行精确定位和结构分析。
Berger等人 （bioRxiv）证明了HPF与氙等离子FIB铣削技术的兼容性，实现了从厚样品中高通量制备薄片。他们的工作实现了近原子分辨率的重建，如 大肠杆菌4.0 Å 的 核糖体 ，强调了 HPF 在保护大分子结构方面的关键作用。
致谢
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Waffle Method: A general and flexible approach for improving throughput in FIB-milling.
Kelley, K., Raczkowski, A.M., Klykov, O. et al.
Nat Commun 13, 1857 (2022)。
Cryo-electron tomographic investigation of native hippocampal glutamatergic synapses
Aya Matsui, Cathy Spangler, Johannes Elferich, Momoko Shiozaki, Nikki Jean, Xiaowei Zhao, Maozhen Qin, Haining Zhong, Zhiheng Yu, Eric Gouaux
eLife 13:RP98458 (2024).
