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低温光学显微镜的新成像工具

LIGHTNING和TauSense如何提高聚焦离子束(FIB)加工的定位精度

Projection of a confocal z-stack. Sum159 cells, human breast cancer cells kindly provided by Ievgeniia Zagoriy, Mahamid Group, EMBL Heidelberg, Germany. Blue–Hoechst - indicates nuclei, Green–MitoTracker mitochondria, and red–Bodipy - lipid droplets Keyvisual-Cancer-cell-under-Cryo_Coral-Cryo_TechNote.jpg

LIGHTNING超分辨率检测和TauSense技术能够获得更好的低温荧光成像,促进了低温光电联用工作流程。

荧光显微镜图像能够为cryo-FIB加工提供定位支持,其质量决定了所制备薄片的结果。本文描述了LIGHTNING技术是如何显著提高图像质量,以及如何利用该技术基于荧光寿命的信息来辨别样品的不同结构。

白皮书内容预览

学习要点

低温条件下的超分辨率LIGHTNING技术

  • 该技术是如何工作的?
  • 反卷积是一种较为普遍的技术,那LIGHTNING有什么特别的地方?
  • 使用STELLARIS Cryo共聚焦显微镜时,LIGHTNING技术如何提高样品定位精度?
  • 使用LIGHTNING技术反卷积后,我可以量化数据吗?

低温条件下的TauSense技术

  • 什么是TauSense技术?
  • TauSense技术如何工作?
  • TauContrast
  • TauScan
  • TauSeparation
  • TauGating
  • 将TauSense技术完全集成到Coral Cryo软件的工作流程中

介绍

冷冻电子断层扫描技术(Cryo-ET)是一种透射电子显微镜(TEM)技术,该技术通过分析一系列倾转图像,对相对较薄体积的样品(约200-300 nm厚)进行成像。通过该技术,可以揭示蛋白质的3D分子结构。

随着近十年来, cryo-FIB和cryo-TEM的样品制备技术飞速发展,,已经可以实现在细胞内部的天然环境中,使用cryo-ET技术解析蛋白质和其他生物分子的结构,分辨率可达到亚纳米级。使用这种方法,细胞需要生长在TEM载网上,再通过投入冷冻将样品玻璃化,然后转移至冷冻-FIB/SEM加工出小窗口(薄片)。随后就可以使用cryo-TEM对薄片成像,获得一系列倾转图像。细胞的成像窗口必须足够薄,以便允许电子束穿透样品。

然而,为了确定样本中的特定点,需要对感兴趣区域进行高精度地定位。目前,这主要是通过冷冻共聚焦荧光显微镜进行3D高精度成像实现的。共聚焦针孔能够消除了离焦光线,特别是在轴向方向,从而提高分辨率和对比度。

在下文中,解释了如何在低温条件下使用LIGHTNING超分辨技术和TauSense基于荧光寿命的工具,使用荧光显微镜更好地辨别和识别目标结构,以便用于后续的电镜工作流程。

低温条件下的超分辨LIGHTNING技术

该技术是如何工作的?

尽管共聚焦显微镜提供了极好的3D扫描成像质量,但在成像过程中仍然会发生衍射现象,从而限制成像的分辨率。该现象是每个成像系统设置的特征,可以描述为所谓的点扩散函数(PSF)。该方法得到的图像是样本与成像系统的PSF和设定条件的卷积(折叠)。衍射现象会产生较为模糊的图像,导致有效分辨率降低和每一个光子定位偏差。同时,样品图像还存在其他干扰信号,如背景和噪声,影响从原始数据中获得的信息。

然而,现在可以通过精密的模型,从样品的离焦区域识别单个光子的干扰信号,然后通过与其原始位置的相关性对其进行反卷积。通过这种方法可以获得超分辨率图像。

反卷积是一种较为普遍的技术众所周知的,但什么是特别的那LIGHTNING有什么特别的地方?

共聚焦显微镜的传统反卷积方法,通常使用一个全局设置进行图像重建,该过程不考虑图像中的不均匀性。因此,携带信息的信号可能被拒绝,而不需要的信号(如背景或噪声)可能被错误地解释为信息。

另一方面,LIGHTNING技术包括位置依赖、精确体素的差异。这种自适应过程能够全自动、准确地恢复任何生物样本的信息,即使在低温条件下的成像结果(图1)。

通过去除不需要的背景信号和噪声,LIGHTNING技术能够提高图像质量。在实际反卷积之前的预处理步骤中,需要确定全局背景值。根据实际局部信号和噪声之间的比值,将全局背景微调至局部背景值中。噪声可以根据其高空间频率进行识别,通过忽略噪声可以更好地获得携带有信息的信号。

图2为使用标准共聚焦显微镜(上图)和LIGHTNING超分辨共聚焦(下图)拍摄的两个代表性的癌细胞图像,其中显示了线粒体(绿色)、脂滴(红色)和细胞核(蓝色)。从对比结果中可以清楚地看到,LIGHTNING技术能够去除背景和噪声,获得对比度较高的图像,更容易识别和辨别目标结构。图像质量的明显改善,使得识别后续相关步骤所需的目标结构变得更为容易。

当在高倍镜下成像时,LIGHTNING技术的影响更加明显,如图2所示的放大区域。

如区域1中的脂滴图像所示,通过LIGHTNING技术能够降低背景和噪声,从而改善信号,更精确地定向观察脂滴结构。

在区域2中所观察到的管状结构也得到相同的结果。LIGHTNING技术提高了线粒体膜的对比度,使管状外观更加清晰,不仅提高了定位效率,而且增强了CLEM光电关联过程的精确度。

使用LIGHTNING技术反卷积后,我可以量化我的数据吗?

答案是肯定的。生成决策掩码的过程基于通用图像处理方法,因此是完全可量化的。整个流程中,没有改变单个光子的强度或定位特征,以及光子计数信息。该流程仅从现有共聚焦数据中提取信息,不做任何修改。

无论是否使用自适应方法,在重建过程中没有局部和相对强度失真。通过使用自适应的、基于决策掩模的方法,将产生伪影或丢失信息的概率降至最低。

图3:共聚焦Z-堆栈的投影。Sum159细胞和乳腺癌细胞由德国海德堡欧洲分子生物学实验室(EMBL)Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy提供。蓝色- Hoechst -表示细胞核,绿色- MitoTracker Green-线粒体,红色- Bodipy -脂质滴。 [Translate to chinese:] Projection of a confocal z-stack. Sum159 cells, human breast cancer cells kindly provided by Ievgeniia Zagoriy, Mahamid Group, EMBL Heidelberg, Germany. Blue–Hoechst - indicates nuclei, Green–MitoTracker Green–mitochondria, and red–Bodipy - lipid droplets

图3:共聚焦Z-堆栈的投影。Sum159细胞和乳腺癌细胞由德国海德堡欧洲分子生物学实验室(EMBL)Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy提供。蓝色- Hoechst -表示细胞核,绿色- MitoTracker Green-线粒体,红色- Bodipy -脂质滴。

低温条件下的TauSense技术

什么是TauSense技术?

TauSense 技术是一个利用基于荧光寿命的信息的工具集。因此,它为理解细胞功能提供了额外的信息。此外,TauSense技术可以提高图像质量,并扩展区分给定标本中荧光基团的能力。TauSense技术可在应用与室温样品和冷冻玻璃化样品。

TauSense技术如何工作?

荧光产生过程中存在一个内在现象,即荧光基团的激发与其光子发射之间具有特定时间间隔。因此,就可以利用脉冲激光激发样品中的荧光基团,测量探测器处的光子到达的时间(图4)。

上述时间间隔被称为荧光寿命。荧光寿命取决于荧光基团种类及其微环境。将两个(或多个)荧光源的贡献进行分开的能力,使TauSense技术成为生命科学的强大分析工具。使用TauSense技术,能够确定光子的到达时间,并开发为一个额外的维度,允许观察微环境变化和多通道荧光基团。

TauContrast

TauSense计算每个独立像素的平均到达时间(AAT),并通过标准强度图像之外的不同颜色将其显示为另一个维度。TauContrast具有特定的荧光寿命强度图(LUT;图5)。

蓝色范围显示较短的AATs,红色显示较长的值。因此,可以从图像中立即直观地区分不同的AATs。通常,反射和某些类型的自发荧光在1 ns以下用“较短”的AATs表示,而荧光蛋白产生的靶信号的AATS则在1 ns以上的“较长”范围内。该结果能够辨别、分离和去除图像中干扰随后光电关联流程的信号。

TauScan

可以使用荧光寿命分布来识别和区分不同荧光寿命的组分,例如样品中的不同荧光标记。利用TauScan,可以将这些分布扫描并分离成预定数量的时间窗(图6)。

数字预设门后进行多指数分量拟合,生成每一个组分到达时间分布的线视图(图6,底部)。这种分布使人们能够以类似于荧光信号光谱分布的方式处理到达时间信息。

该方法能够获得信号的时间离散信息,然后根据光子通量中包含的到达时间信息,设定适当的时间窗口分割光子信号。在区分信号后,根据光子的空间编码可获得相应的图像。TauScan实验获得的图像是包含荧光寿命分布中时间离散信息(上文解释的时间窗口)的强度图像。

TauSeparation

TauSeparation技术使用组分的荧光寿命分布,如TauScan所得的分布数据,以此分离样品中的荧光物质。用户借助在线图表决定最具代表性的平均寿命组分的值。然后TauSeparation选择合适的时间窗口,在单独的图像中显示该组分(图7)。这样,即使是不能通过其光谱性质区分的荧光基团,也可以通过不同的荧光寿命强度图颜色进行分离和直观的辨别。因此,该方法可以有效区分电子显微镜的目标结构,增加光电关联工作流程的可靠性。

TauGating

除了分离组分,人们还可以去除特定的时间范围内显示的信息,这样就可以进一步区分目标信号和非贡献信号(图8)。

对于电子显微镜工作流程而言,特别是应用与载网上的低温电镜技术,有时可以观察到碳层或样品支撑层的自发荧光和反射信号。将TauGating技术应用于相关通道可清除目标荧光信号,因此增加了下游工艺(如FIB切割)定位精度。

完全集成到Coral Cryo软件工作流程中

LIGHTNING和TauSense这两种模式都被完全集成到Coral Cryo 工作流程中(图9)。

对于LIGHTNING技术而言,软件提供了一个向导流程,指导用户如何根据需要定义合适的设置(例如,更高的采集速度与更高分辨率)。这些相互关联的参数会被自动设定,以得到预期的高质量图像。

所有TauSense工具都直观地嵌入到探测器设置中,可以通过双击鼠标激活(图9)。

总结

LIGHTNING和TauSense技术是帮助用户提高图像质量和改善图像数据信息内容的工具。LIGHTNING技术增强了在低温条件下获得图像的分辨率,TauSense技术帮助用户将目标荧光信号与其他荧光基团甚至不需要的荧光基团(如自发荧光和/或反射)的信号区分开。这两种工具都使用户能够进行低温工作流程,以更可靠和准确地识别冷冻玻璃化样品内的目标结构,特别是对于低温电子断层扫描样品。

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