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FRAP实验步骤式指南

运用TCS SP8共聚焦显微镜开展FRAP实验

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漂白后荧光恢复(FRAP)已被认定为观察大分子平移扩散过程方面使用最为广泛的一种方法。由此产生的信息可用于确定动力学性质,如扩散系数、流动分数和荧光标记分子的传输速率。FRAP实验利用了短激光脉冲的荧光团辐照。先进的激光扫描显微镜如TCS SP8共焦系统等具有使用高强度激光进行光漂白和使用低强度激光进行图像记录的优点。利用LASAF应用向导,您可以选择不同的方式来开展FRAP实验。您可以调整各种实验的计时参数,例如中等、快速或多步骤动力学。此外还可以进行相关的实验,如光活化和光转化或FLIP(光漂白中的荧光损失)实验。

对于极快速动力学,可以应用FlyMode(飞行模式)。在这种模式下,在扫描头的x方向返回时读取信号,为FRAP实验提供了线之间的时间分辨率,而不是帧之间的时间分辨率。根据所需的光漂白能力,实验人员可以选择ROI光漂白或ROI与放大光漂白结合一个或多个光漂白步骤。如果需要多个光漂白间隔,自由y格式将减少光漂白过程中的扫描时间。

FRAP向导已改善功能性。随着TCS SP8显微镜的推出,FRAP向导还为您带来了附加特性:

  • z堆栈;
  • 光漂白和后光漂白之间的循环1;
  • 行间顺序扫描;以及
  • RS模式下用于光漂白的放大(“FRAP可变焦距镜头”)。

选择FRAP向导

首先在用户界面(UI)顶部的“TCS SP8”下选择FRAP-向导选项[图1]。

在向导界面的顶部,各工作步骤显示成按钮:“Overview”(概述)、“Set Up”(设置)、“Bleach”(漂白)、“Time Course”(时间过程)、“Evaluation”(评价)(图2)。

“Overview”概述当中提供了向导的说明并解释了每一个步骤所应进行的操作。

步骤1:设置 – 为预漂白和后漂白设定参数

成像

首先要描述具有放大功能的FRAP例行程序:

点击“Setup”设置按钮(见下图3)来为预光漂白和后光漂白调节硬件参数。

请注意:

在配备混合探测器(HyD)的TCS SP8系统上建议使用PMT作为FRAP实验的首选探测器。在光漂白过程中,感兴趣区域(ROI)内通常达到高强度水平,这可能导致HyD探测器关闭以保护其免受光子过载的影响。由于随后必须主动打开检测器,否则光漂白序列将丢失而且无法进行量化。

扫描模式

如果3D堆栈应当予以更加细致的分析,则可以将扫描模式从xyt变更为xyzt(图4)并分析一段时间内的整个z堆栈。然后在xyzt模式中对预光漂白和后光漂白序列进行扫描,堆栈内一个平面的光漂白可进行定义。

堆栈中的任何平面都可以定义为光漂白。实际z平面的位置(图5;①)将自动保存并显示在UI的底部。光漂白脉冲只能在这个平面上执行。在光漂白步骤中不会获得z-堆栈。

采集速度

根据分子的预期迁移率,可以调整适当的采集速度。因此,对于自由扩散的分子,应使用1800 Hz线频率的双向扫描速度。选择256 × 256像素的图像格式,可以每79ms记录一个图像。

顺序扫描

选择“Sequential Scan”顺序扫描(图6)来避免多通道设置时的干扰。这种扫描模式也适用于光转化,即使用光控开关蛋白如KAEDE或DENDRA2进行实验。

光剂量

允许在监测和光漂白之间获得最高动态范围,在配置/激光菜单的80-100%范围内对氩离子激光功率进行调节(图7)。

成像时将AOTF(声光可调滤波器)数值设为低百分比。

FRAP加速器

如果激发光量不足(例如,在共振扫描的快速采集期间),建议选择FRAP加速器(图8),如果系统已有相应配置。一旦激活,FRAP加速器选项在整个实验中会一直保持激活状态。

如果该选项已激活,则扩束器从光束路径上撤回。因此,物镜的后光圈不再完全充满光(见图9A)。进入物镜的光量是相同的,但集中在中心的一个点上,根据物镜的不同,光的强度大约要大2到5倍(见图9B)。事实上,使用FRAP加速器选项,可以用多种光强度(更集中的光与不集中的光)照亮。

针孔大小

处理较薄的细胞层时,您可以将针孔大小设为2个艾里单位或以上。将针孔打开可改善信噪比,且您将收集到样本更深入的动力学信息。

请注意:

将强度设置为低于饱和但略高于零,因为零值设置可能会干扰数据分析。适当的查找表(辉光上方/辉光下方)有助于调整增益/偏移。确保所有实验使用相同的增益设置。为了再现性,建议现在或最后一步保存(图10)设置漂白时间过程选项卡中的所有设置。然后所有硬件设置,包括ROI形状和位置等都将得到存储。

步骤2:漂白 – 定义光漂白参数

点击“Bleach”(漂白)按钮(图11)来设置光漂白参数。左侧会看到所有选项的描述说明。

首先选择应用ROI ① 还是点漂白②(图12)。

您可以选择以下任意选项(图13):

Flymode(飞行模式)①

为整个FRAP系列提供更快的时间分辨率。取代逐帧时间分辨率后可以实现逐行时间分辨率。您可以将时间分辨率降低到0.35 ms,因为恢复测量已经在行间而不是帧间完成。这一事实意味着恢复测量开始时尽可能接近零时(t0)。

FlyMode(飞行模式)结合了光漂白扫描和光漂白后的第一次图像扫描(图14)。光漂白在前进运动中使用感兴趣区扫描()ROI)功能和高激光功率一起执行。在回扫期间,激光强度设置为成像值(AOTF开关以微秒为单位进行工作)。因此,与光漂白帧同时获取第一图像。所以,漂白和数据采集之间的延迟时间小于扫描一行所需时间的一半。

放大 ②

在绝大多数光漂白应用中,我们推荐“Zoom In”(放大)选项。然后将光漂白期间的扫描场最小化,让更多的光施加到ROI上。

使用TCS SP8系统时,共振扫描头同样可以进行放大。

更改漂白格式 ③

根据定义的ROI大小在光漂白(条带扫描)期间减少扫描线的数量。当需要多个间隔(例如10个或更多)时,您可以使用此选项来加速光漂白。此选项可以与“Zoom In”(放大)结合使用。

将背景设为零值 ④

启用“Zoom In”或“Flymode”时推荐该选项。

放大:

通常ROI外部区域会在背景强度下曝光。如果放大图像,这种背景强度会造成光漂白。使用“设置背景为零”,曝光的ROI外部区域将不会接收到光。

FlyMode:

FlyMode(飞行模式)处于活跃状态时,您会获得前进通道和回扫通道(见以上内容)。使用“将背景设为零值”时,前进通道将不会再预漂白和后漂白期间看到光线。只有在光漂白步骤期间,前进(左)通道才会有光进入到ROI内。

扫描后删除漂白图像 ⑤

通常光漂白的ROI非常明亮,在许多实验中放大用于光漂白,但会妨碍有意义的量化。对于“更改漂白格式”选项同样有效?对于这些情况,“扫描后删除漂白图像”选项可避免废弃数据的累积。

为所有ROI适用激光设置 ⑥

多个ROI都在相同激光线下曝光时就可以选择该选项。现在绘制用于漂白的ROI并定义AOTF数值来调节激光功率用于漂白。

使用多道激光线和ROI进行光漂白

单道激光线激活用于多个ROI时点击ROI Configuration(ROI配置) ⑦。提前解除对“为所有ROI使用激光设置”的勾选。

共振扫描模式下有效光漂白的预状态调节

如果需要非常快速的扫描模式(例如,测量水介质中的扩散),您可以采用512 × 128格式进行双向扫描,这会让每帧的时间变得非常短,即12 ms。这里建议应用多个光漂白帧,例如三个或四个,以应用足够的光进行光漂白。

因照明时间太短导致光照太少时可进行补偿,您可以使用:

  • 光漂白期间的放大(使用TCS SP8系统,共振扫描头也可以提供放大)[FRAP可变焦距镜头]。
  • 设置中的FRAP加速器选项。

光活化

您也可以为光活化使用FRAP向导(例如在使用PA-GFP时)。打开UV(紫外线)-快门,然后在光漂白步骤中使用405激光线而非488激光线。

步骤3:时间过程 – 定义预漂白、漂白和后漂白间期的数量

接下来选择时间过程(图15)来定义预漂白、漂白和后漂白间期的数量。1800 Hz扫描速度(双向扫描)的典型实验和256 × 256格式可以定义如下:

您也可以通过单击“+”来添加其他时间刻度。如果需要,实验可以在中途停止,例如在漂白后。然后将引导用户进入评估步骤。如果完全恢复的总时间未知,则此功能特别有用,因为该功能可允许用户在达到完全恢复(即强度不再增加)后立即在漂白期间结束实验。换句话说,不需要等到获得了预测的帧数。

 

帧数

最小时帧

每帧时间 [ms]

预漂白

10

79

漂白

1

79

后漂白1

100

79

后漂白2

10

1000

后漂白3

10

5000

表1:预漂白、漂白和后漂白步骤中的总帧数和帧速参数。

采集速度

在时间分辨率较高的情况下,需要调整采集速度来分辨恢复的动态范围。因此,理想情况下,在恢复一半的时间内至少采集10个数据点。

FRAP实验循环

要实施FLIP实验,您可以设定漂白和第一次后漂白步骤之间的重复次数①(图15)。

FRAP实验持续时间

初始实验应持续开展,直到检测到荧光强度没有明显的进一步增加。如果您想在保存的设置中包含ROI和时间过程,可以在步骤1或最后一步中执行此操作。单击“Run Experiment”(运行试验)可开始实验。实验自动运行,然后进入评价步骤。

请注意:

如果使用荧光蛋白做实验,使用不同时间标度的后漂白序列可能会导致时间标度转换过程中的强度降低。在实验过程中改变成像频率可以改变被驱动进入黑暗状态的荧光蛋白的比例(参见下面的参考文献16)。另一个策略是定义40或50个预漂白间隔,在预漂白系列的前10到20个间隔内初始强度降低后达到强度的稳定状态。

步骤4:评价

现在展示恢复图(图16)。图中显示所有强度值在ROI上对全部帧进行平均计算。该图可通过点击鼠标右键来导出到Excel文件当中。

1. 可保存实验条件和程序;

2. 报告生成xml格式的数据表;

3. 背景可减除;

4. 拟合可应用到数据;

下载pdf

Confocal Application Letter - FRAP with TCS SP8 (pdf, 2MB)

建议背景阅读

  1. Phair, R.D., Misteli, T. (2000) High mobility of proteins in the mammalian cell nucleus. Nature. 404:604
  2. Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils R., Ellenberg, J. (2002) Nuclear Envelope Breakdown Proceeds by Microtubule-Induced Tearing of the Lamina Cell 108:83-96
  3. Axelrod, D., Koppel, D.E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W.W. (1976) Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16:1055-1069
  4. Phair, R.D., Misteli, T. (2001) Kinetic modelling approaches to in vivo imaging. Nat Rev Mol Cell Biol. 2:898-907
  5. Snapp, E.L., Altan, N., Lippincott-Schwartz, J. (2003) Measuring protein mobility by phtobleaching GFP chimeras in living cells. Curr. Prot. Cell. Biol. 21.1-21.1.24
  6. Ellenberg., J., Siggia, E.D., Moreira, J.E., Smith, C.F., Presley, J.F., Worman, H.J., Lippincott-Schwartz, J. (1997) Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: Targetting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis. J. Cell. Biol.138:1193-1206
  7. Siggia, E.D., Lippincott-Schwartz, J., Bekiranov, S. (2000) Diffusion in inhomogenous media: Theory and simulations applied to a whole cell photobleach recovery. Biophys. J. 79:1761-1770
  8. Lippincott-Schwartz, J., Altan-Bonnet, N., Patterson, G.H. (2003) Photobleaching and photoactivation:following protein dynamics in living cells. Nature Cell Biology Suppl:S7-S14
  9. Braeckmans, K., Peeters, L., Sanders, N.N., De Smedt, S.C., Demeester, J. (2003) Three-Dimensional Fluorescence Recovery after Photobleaching with the Confocal Scanning Laser Microscope. Biophysical Journal 85:2240–2252
  10. Misteli, T., Gunjan, A., Hock, R., Bustink, M., Brown, D.T. (2000) Dynamic binding of histone H1 to chromatin in living cells. Nature 408:877-880
  11. Beaudouin, J., D. Gerlich, N. Daigle, R. Eils, J. Ellenberg. Nuclear Envelope Breakdown Proceeds by Microtubule-Induced Tearing of the Lamina. Cell 108, 2002: 83-96
  12. Lippincott-Schwartz, J., E. Snapp, A. Kenworthy. Studying protein dynamics in living cells. Nature 2: 444-456 (2001)
  13. Press, W.H., B.P. Flannery, S.A. Teukolsky, W.T. Vetterling. Numerical Recipes in C: The Art of Scientific Computing, 2nd edition, Cambridge University Press (1993)
  14. Rabut, G., J. Ellenberg. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP, in Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Goldman, R.D. and Spector, D.L. (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York: 101-126 (2005).
  15. Snapp, E.L., N. Altan, J. Lippincott-Schwartz. Measuring protein mobility by photobleaching GFP chimeras in living cells. Curr. Prot. Cell. Biol., chapter 21.1 (2003)
  16. Weber, W., V. Helms, J.A. McCammon, P.W. Langhoff. Shedding light on the dark and weakly fluorescent states of green fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci USA, 96 (11): 6177-6182 (1999)

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