本文将探讨不同类型的多标技术及其优缺点。具体来说，我们将介绍多重成像的主要类别：染色和成像合二为一、单通道低倍成像、全功能 omics 解决方案以及循环染色。我们还根据生物标记物的数量、易用性、多载玻片、生物标记物选择的灵活性和分辨率对这些技术进行了比较。
此外，我们还提供技术信息、利弊分析和背景资料，为您了解当前的多标情况奠定基础。最后，我们将介绍我们的开放式多标解决方案 Cell DIVE 如何适应快速发展的多标领域，以及如何解决执行研究过程中的许多陷阱和挑战。
简介
多标免疫荧光成像技术是生命科学研究领域一项相对较新、令人兴奋且发展迅速的技术。如果您从事组织研究，并希望从单个样本中获取更多信息，请考虑将多重成像技术添加到您的工具箱中。在最基本的层面上，多重免疫荧光是一个术语，它描述的技术可以让您用比传统荧光实验更多的生物标记物（6 - 60 多种）来探查单一样本。
对于刚涉足这一领域或刚刚开始研究多标的研究人员来说，要了解现有的不同类型解决方案可能比较困难，而要最终选择解决方案则更加困难。请继续阅读，了解在评估多标成像解决方案时需要考虑哪些因素，每种解决方案如何与您的研究相匹配，以及每种方法带来的局限性。
图 1：使用循环染色多重解决方案 Cell DIVE 对胰腺癌进行成像。所示为 16 种生物标志物：Collagen、NaK、pCadherin、PanCytokeratin、PKM2、SMA、Vimentin、AE1、β-caenin、Caspase9、CD3、CD4、CD8、CD20、CD31 和 CD45。
染色和成像合二为一
对于这类多标系统，染色过程是通过灌流或微流体技术自动完成的。染色机可以集成到成像设备中，也可以分离但密切相关。这种多标解决方案的优点是使用方便--通常试剂是设计好的套餐，减少了研究设计所需的工作量，只需极少的动手时间就能完成单张玻片的多标实验。
由于这种溶液的容量较小，因此必须一次处理一个样品，或小批量处理（< 3 张幻灯片）。对于小规模的研究群组，这种情况是可以接受的，但随着研究的发展，要处理更大的玻片量（10 至 100 张幻灯片），同一研究中的幻灯片可能要相隔数周甚至数月才能处理完毕，这就带来了可能影响结果的变异性。此外，由于许多一体化解决方案都使用成套试剂，因此生物标记物面板的灵活性可能会受到限制。
单次12色以下成像
这些系统可以对 9-12 个生物标记物成像，但只需一次染色和成像，通常使用光谱拆分技术。由于这些系统是单次成像拆分的，因此具有很强的可扩展性，可以直接快速地处理许多玻片。此外，由于可检测的生物标记物数量有限，还可设计定制套餐
相当容易。
单次成像技术的缺点是成像生物标记物的数量较少。您可能可以对数百张切片进行成像，但每张玻片 9-12 个生物标记物，无法获得组织微环境的全面图像，而超多标技术则可以提供这种图像。
一体化多组学解决方案
在复杂性方面，与之相反的解决方案是利用多组学技术（质谱或核酸测序）从组织区域中提取信息。在这些解决方案中，组织区域可从整块组织中切除并进行处理，以获得蛋白质或核酸表达数据。这些解决方案具有最高的复杂性，可同时分析数千种生物标记物。
然而，这些解决方案有两大缺点。首先，为进行质谱分析或 RNAseq 分析而切除组织区域会破坏这些区域。使用这些技术分析的组织无法重新利用于以后的成像或未来的问题。如果研究的是病人的珍贵组织，这一点就尤为困难。其次，虽然生物标记表达数据可以映射回组织图像，为表达谱增加空间背景，但这种映射的总体分辨率低于使用直接荧光成像的技术。
循环染色
顾名思义，循环染色技术要求对样本进行循环染色和去染色。在每个循环中，都会使用新的生物标记物，最终得到包含许多生物标记物的图像，但通常不超过 100 个。在循环染色工作流程中，染色发生在成像仪之外，因此适合使用自动染色技术批量处理玻片。这样就可以通过迭代染色工作流程共同处理大型研究队列。循环染色技术在生物标记物的选择方面往往非常灵活--选择使用多少生物标记物、使用哪些生物标记物、从哪里获得生物标记物--选择权在你手中。
不过，循环染色技术的可扩展性和灵活性也有代价。在每个周期中，必须染色和去染色各一次--并成像两次。如果使用传统的盖玻片方法，这意味着样本在每个循环中都要盖玻片和去盖玻片两次。盖玻片和去盖玻片过程会损坏珍贵的组织样本，并严重影响循环染色技术的易用性。
为什么我们不能拥有这一切？
正如许多事情一样，在选择多标实验在设计研究时，请考虑以下几点：您需要的是易用性还是规模？或者，您需要做许多玻片还是许多标记？最后，您的解决方案能否跟上研究的发展？保存组织重要吗？
不幸的是，你的研究决定了哪些妥协是可以接受的，而在多标领域，妥协是进步的阻碍这一点越来越明显。
比较现有的多标技术
| 染色和成像合二为一 | 单次12色以下 | 循环染色 | 一体化 多组学 | Cell DIVE 和 ClickWell | |
|---|---|---|---|---|---|
| 生物标志物数量 | + | + | + | ++ | |
| 易于使用 | + | + | + | ||
| 多张玻片 | + | + | + | ||
| 生物标记物选择的灵活性 | + | + | + | + | |
| 分辨率 | + | + | + | + |
表比较现有的多标技术
我们怎样才能做得更好？
在设计研究时，找到一种能满足研究需求的多重成像解决方案至关重要。Cell DIVE 多标成像解决方案是专为简化成像而设计的系统，易于扩展。基于循环染色过程，Cell DIVE 可为 60 多种生物标记物生成清晰的组织成像。Cell DIVE 使您能够通过创新的无盖玻片工作流程和温和的去活化程序延长珍贵样本的寿命。同样的工作流程可以缩短样本处理时间，让您有时间专注于洞察力的创造。
Cell DIVE 解决了其他多重成像技术固有的许多技术难题。迭代染色法解决了单程染色法的复杂性问题，通过包含 350 多种预验证抗体的列表，最大限度地减少了抗体测试和验证的前期工作。ClickWell 玻片载体消除了其他反复染色方法的主要痛点--重复盖玻片和去盖玻片。
ClickWell 是一种创新的新型载玻片载体，无需放置或移除盖玻片即可使用染色和染料灭活溶液，确保在多轮成像过程中将组织损伤降至最低。
此外，由于 ClickWell 的外形尺寸小，Cell DIVE 可以很容易地与机器人平板装载机配合使用，无需人工干预即可将多个 ClickWell 平板添加到相机中。这种兼容性使研究人员能够从根本上提高实验的规模和效率。通过凸轮将载玻片精确放置到载体中，用户还可以根据需要取出载玻片，在 ClickWell 外进行染色，从而获得适合任何实验室专业技术的多种染色方法。
Cell DIVE（尤其是与 ClickWell 搭配使用时）是一种开放式多重成像解决方案，可提供高质量图像、自动化和准确的组织生物学洞察力。多标成像技术复杂多变，但 Cell DIVE 可为您提供关键优势，确保生成准确、可重复的数据。
