超薄获得高质量的超薄切片

超薄切片是电子显微学的重要技术，能够制备厚度均一的薄片以进行高分辨成像和分析表征。由于超薄切片技术能够在室温和低温条件下精确且灵活地制备样本切片，它已成为生命和材料科学研究中不可或缺的工具 [1-6]。超薄切片帮助科学家精确控制从样本中切取的薄片厚度，这对于制备出满足扫描电子显微镜（SEM）或透射电子显微镜（TEM）成像要求的切片至关重要 [1]。薄片切片厚度的范围在TEM测试中一般为50-300纳米，而SEM阵列断层扫描则通常需要低于50纳米的切片 [2]。超薄切片所制备的切片质量对各个科学领域实验结果的可靠性和可解释性具有深远影响。因此，确保切片质量的一致性对于得到准确的数据，以及探究实验的科学意义至关重要[1-6]。

SEM和TEM能够在室温和低温条件下对生物和材料样品进行高分辨率成像 [5]。这些电子显微技术为观察样品结构细节提供了手段，超越了光学显微方法的分辨率限制[5]。无论具体的研究目标如何，在相同条件下对多个样本进行成像和分析时，一致且可靠的薄片厚度都至关重要[1]。因此，超薄切片是制备样品薄片，以成功进行下一步工作流程的首选方法 [3]。

获得厚度一致的样品切片，对后续实验进程具有至关重要的意义 [1]，而对于这方面工作超薄切片技术仍然面临一系列挑战。

在制备过程的不同步骤中，常见的问题包括切片刀或样本夹持不稳、外部影响（如建筑物振动）以及超薄切片机参数设置不当 [8]。要获得无瑕疵的均匀薄片，需要正确地包埋、固定、脱水、聚合，以及仔细考虑样本组成、切片刀参数、工作场所清洁度和最小切片厚度 [9]。偏离标准切片程序可能会引入其他问题，如切片污染和切片痕迹等 [9]。此外，目前已确定的切片问题，可能会忽视新切片方法和仪器等引起错误 [8]。为确保样本切片制备质量，讨论常见的切片痕迹，并处理样本制备、刀刃质量、切片参数、切片展开、载网收集、染色和仪器洁净度等方面的问题至关重要 [9]。

通常，超薄切片质量方面问题往往与样品自身性质有关，包括硬度、弹性和样品组成。样品整体密度不均匀或异质结构可能会导致切片厚度不一致或发生形变。此外，超薄切片容易因诸如褶皱和折叠等问题而受损，其可能源于样品处理或制备不足，例如使用钝的刀锋或未使用静电发生器 [1]。

在切片之前，样品会经历冷冻、树脂包埋或冷冻替代等固定和硬化过程。整个过程能确保材料足够坚硬，以进行高质量的超薄切片 [1-6]。因此，合适的样品制备是确保超薄切片质量的关键步骤 [1]。

在超薄切片中，切片质量的一致性对于准确进行形态学分析和精确测量至关重要。切片厚度的变化会扭曲细胞结构的尺寸和定量数据，不利于开展对比研究工作 [1-6]。同时，它们还会影响下游实验的结果，如免疫标记和光谱分析。均匀的切片可确保目标分子或感兴趣区域的持续暴露，从而优化标记程序的效率和可靠性。

确保精确的切片质量，对于最大化提升与超薄切片相结合分析技术的敏感性、特异性和可重复性至关重要。在体积电子显微镜（Volume EM）领域尤为重要，因为其需要使用大量数据来准确重建3D分子结构。这种方法所需的数据通常是从数以百计到数以千计的连续切片中获取的。

树脂（环氧树脂，Araldite CY212，Agar Scientific）按照标准方法进行聚合。使用没有嵌入生物组织样本的树脂块，以便专门关注切片质量，而不受样本制备方法可能产生的影响和偏差。使用UC Enuity超薄切片机对纯环氧树脂块进行修块和切片。整个切片过程中，使用50纳米、70纳米和100纳米的进给设置选择不同的切片厚度值，切片速度为1毫米/秒。

使用超薄切片机在纳米尺度上进行样品切片，在光照下水槽中漂浮的切片会呈现不同的颜色，这是光干涉效应的结果 [7]。这种干涉颜色与切片厚度之间的关系提供了一种视觉测量手段 [7]。厚度为50纳米的切片呈现银色，而接近100纳米厚度的切片则逐渐呈现金色，而厚度超过100纳米的切片则呈现多种颜色（图1）。透射电子显微镜（TEM）分析通常需要厚度在50纳米（银色）和100纳米（金色）之间的切片。尽管在某些情况下，所需的切片厚度可能会偏离这个范围。切片或条带在水上漂浮时呈现的颜色可以指示其厚度 [7]。

在UC Enuity上，可以通过调整进给步长来改变切片的厚度 [1]。然而，切片边缘的质量在很大程度上受到切片速度的影响 [1]。当速度过高时，会导致边缘不锐利，从而降低切片的质量 [1]​​​​​​​​​​​​​​。因此，必须在进给步长和切片速度之间保持平衡，以获得符合所需质量标准的理想切片 [1]​​​​​​​​​​​​​​。通常，切片速度为1毫米/秒，这是刀具制造商（瑞士Diatome公司）推荐使用的速度。

图2展示了在切片速度和进给之间取得正确平衡后可以获得的高质量切片。

图3展示了阵列层析成像实验连续切片工作流程的结果。在实验过程中，UC Enuity自动制备多个切片条带，以便稍后在较大的基底（如载玻片或硅片）上收集。图3展示了收集前的切片条带。

基于切片干涉颜色和厚度关系，所有三个切片条带中，总共90张切片的厚度一致。

图4展示了使用进给从30纳米增加到180纳米，所获得的嵌入环氧树脂中的组织切片。由于嵌入的组织样品在200纳米及以上厚度参数下切片效果不佳，因此该系列没有扩展到180纳米以上。该案例展示了UC Enuity的精确度，确保用户能够无缝地设置所需的进给，从而获得不同的目标切片厚度（见图1）。

切片质量对于电子显微镜样品制备至关重要。UC Enuity超薄切片机凭借70多年的专业经验，是制备锋利、无失真且厚度一致的切片，以进行电子显微镜分析的重要工具。

UC Enuity因其稳定的切片质量和用户友好的操作脱颖而出，无论是经验丰富的研究人员还是新手都能从中受益。通过提供高质量标准的可重复实验结果，UC Enuity减少了切片过程中经常遇到的问题，从而便于直接比较实验数据。这不仅有助于节省时间和资源，还避免了重复样本制备和图像采集的工作。

1. R. Ranner, J. DeRose, Introduction to Ultramicrotomy: Ultrathin sectioning of biological specimens and materials for microscopy and array tomography (AT), Science Lab (2019) Leica Microsystems.
2. R. Ranner, J. DeRose, High Resolution Array Tomography with Automated Serial Sectioning: Faster 3D imaging of cellular and protein structures, Science Lab (2018) Leica Microsystems. 
3. H. Gnaegi, Ultramicrotomy Techniques for Materials Sectioning: Sectioning of polymer and brittle materials for electron microscopy – free webinar on-demand, Science Lab (2023) Leica Microsystems. 
4. F. Assen, Array Tomography for SEM 3D Reconstruction: Webinar On-Demand - Benefits of automated serial sectioning with the ARTOS 3D ultramicrotome, Science Lab (2018) Leica Microsystems.
5. A. Pinto, Streamline your EM Sample Preparation Workflow for Biological Applications: A guide to electron microscopy sample preparation, Science Lab (2023) Leica Microsystems. 
6. Sitte H. 1981, Ultramicrotomy: Frequent faults and problems. AO/Reichent, Vienna.
7. Toshio SAKAI, Relation between Thickness and Interference Colors of Biological Ultrathin Section, Journal of Electron Microscopy, Volume 29, Issue 4, 1980, Pages 369–375,
8. Koster, A. J., Klumperman, J., & Meijer, E. (2007). Sectioning of immuno-labeled Lowicryl sections for correlative fluorescence and electron microscopy. Nature Protocols, 2(10), 2480-2489.
9. Leduc, C., Si, S., Gautier, R., Gao, J., & Zheng, L. (2013). Advances in electron microscopy for the imaging of viruses. Current Opinion in Virology, 3(1), 47-52.