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专家在低温扫描电镜工作流程高压冷冻和冷冻断裂方面的知识

伦敦国王学院超微结构成像中心主任Roland A. Fleck专访

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英国伦敦国王学院超微结构成像中心专注于研究生命科学,特写是神经生物学课题,即脑组织,以及如何突触囊泡如何在膜上融合。他们也支持相关的一些研究,例如疟原虫项目或化学行为,特别是动物细胞模型系统和发展。深入了解实验室工作方法并了解在EM样本制备过程中低温扫描电镜研究的优势。了解如何将高压冷冻、冷冻断裂和冷冻传送添加到低温扫描电镜工作流程中,以及徕卡组合如何确保这些不同步骤之间的兼容性。

关于Roland A. Fleck

FRCPath, FRMS的博士ROLAND A. FLECK是超微结构成像方面的教授以及伦敦国王学院超微结构成像中心的主任。他专门从事低温下细胞损伤的基础研究,在冷冻保存机制研究过程中,他发展了冷冻断裂/组织冷冻蚀刻准备方面的专业知识和更广泛的冷冻-显微技术。他作为超微结构成像中心的主任,支持通过常规室温和冷冻电子显微镜观察对细胞和组织进行高级的三维研究。他也是哥本哈根大学卫生与医学科学系的客座教授、乌克兰国家科学院,乌克兰哈尔科夫低温生物学问题研究所的低温生物学联合国教科文组织主席。

您的部门做什么,在您的实验室,主要使用什么工作流程?徕卡工作流程组合如何支持它们?

我们支持在国王学院进行的所有研究活动,主要是生命科学方面的研究活动,但我们也支持材料与化学科学基础研究。我们使用的工作流程是室温和冷冻EM之间一半一半的比例。室温研究支持诊断性EM用于穿刺活检,它非常直接和常规。这是针对室温样本制备的EM TP,然后是用于切片的EM UC7切片刀,最后是采用透射电镜成像。也有大量更先进的用于切片的细胞和组织室温样本制备,同时保持定向,然后成像。也在树脂中制备样品,也用于非常常规的系列块面扫描显微镜的处理。但我们使用徕卡振动切片机准备组织。

我们采用高产量冷冻技术,执行大量的Tokuyasu工作,轻轻固定,但在-80°C的超低温冰箱中进行切片,然后进行胶体金标记和采用透射电镜成像。然后是采用有点更加先进的技术执行高压冷冻、冷冻置换、胶体金标记和断层扫描工作流程。我们还有额外的纯冷冻的工作。例如,我们有一些结构生物学、单颗粒项目,它采用EM GP、液体吸附投入和低温透射电镜,我们也采用CEMOVIS技术制备组织冰冻切片。因此,有高压冷冻和冷冻切片和低温透射电镜工作流程。然后是低温扫描电镜工作流程。本质上,我们使用高压冷冻EM ICE、冷冻断裂系统EM ACE900、EM VCT500传送和EM VCM工作站,以及JEOL 7800启动带有VCT冷冻台的低温扫描电镜。

低温扫描电镜研究有什么益处?

这简直是太快了。就像我们前几天讲的那样,我把一份样品带进实验室,在不到两个小时的时间内,就采用扫描电镜获得了高分辨率图像。我们在这中间吃了午饭。这非常方便。所有这速度很快,现代扫描电镜的性能,所以,采用它获得的膜信息和采用透射电镜获得的信息一样有价值。由于扫描电镜具有信号采集的性质,所以您也能获得地形信息。

您通常采用低温扫描电镜工作流程研究什么类型的样品呢?

细胞和组织。细胞特别有趣。所以,您想要采用相当高的放大倍数观察的所有相对复杂并且具有不同细胞器和结构的样品都非常适合采用低温扫描电镜研究。例如,果蝇胚胎一样的东西具有大量的组织复杂性,所以它非常好。疟原虫寄生在红细胞内,这是因为红细胞是一种有趣、复杂的机构,但它有些大,无法制成尺寸合适的切片,从而采用透射电镜观察。而扫描电镜为您提供更广的视野和高放大倍率,所以对您来说非常有价值。

您在那些领域使用高压冷冻仪EM ICE?

高压冷冻仪非常有用,它在工作流程中不可或缺。使用它的时候,可以同时进行电刺激,神经科学家非常喜欢这一点。在采用电刺激之前,神经科学家也采用光刺激。我们有兴趣将光刺激重新用于其他光学响应样品。我们也采用管系统,在连锁载体上制备6 mm和3 mm的样品,所以它是一种非常通用的工具。

您采用什么标准,所以选择了EM ICE呢?

服务和支持。我认为,实际上,它质量很高。在我看来,它是HPM100的改进版本。原则上,它传递冷却背后的理论是传递冷却和使热量远离样品的最佳方式。和冷却剂湍流输送相比,它非常高效。我并不非常热衷于EM PACT的配置,这种配置有冷却和压力的分离。EM ICE回到了和HPM100相同的基本设计,但也有一些改进。我认为它在理论和技术设计方面非常好,我也可以获得可靠的服务和支持。

EM ICE的可用性怎么样呢?

针对它开展人员培训非常容易。但我认为,如果您在使用较多的手动仪器方面经验丰富,您可以很快掌握它的使用方法。它和HPM100的区别是,在HPM100上,我可以较快地把样品传送到液氮里,但我认为,对于中等水平的操作员而言,在EM ICE上操作的速度也一样快,所以产品非常成功。它容易使所有人的工作都能达到相同的标准。

您为什么选择在您的实验室使用EM ACE900?

因为我采用冷冻断裂系统工作了多年,我认为这个技术很通用。它是一个非常强大的高真空冷冻理工具,在我的大部分工作流程中,它处于中间环节。所以,我有高质量的镀膜仪器(ACE600/900),样品室通常都在真空环境下,所以非常清洁,它将真空传送到扫描电镜的能力非常突出。即使您并不是很有经验,您也能得到良好的结果。这就是原因。它是非常强大的一套设备。

采用冷冻扫描电镜和传统复型透射电镜工作流程执行冷冻断裂研究的前景如何?

我个人认为,因为现代FEG(场发射电子枪)扫描电镜性能较好,能轻松实现多用途,所以具有冷冻断裂功能的低温扫描电镜用途更广泛。如果您在它后面放置了兼顾的高压冷冻系统、冷冻断裂系统、冷冻传送系统,您应该能够使用它执行常规高分辨率工作,但您必须理解该流程。但现在,工作流程可供中等水平的用户使用,您不必成为让它发挥全面工作的专家。在传统冷冻断裂方面,我的个人感觉是,如果将其与免疫标记技术和较先进的EM技术结合起来,它就可以发挥作用,但它们都很难正确开发和应用。

采用徕卡工作流程执行研究时,它具有那些优势?

理论上主要是可用的不同仪器之间的兼容性。最好的情况是,适配板(装样品的容器)应该与我想做的冷冻断裂工作的类型匹配,该工作应该与进入扫描电镜时可用的阶段相匹配。如果我想要采用不同的组织执行冷冻置换,也应该采用相同的方法,所以,它可以确保各种耗材都和器械匹配,并且能在工作流程中轻松传送到下一台器械。在很多情况下,采用徕卡显微系统可以实现这一点。

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