基于激光的视神经再生研究新方法

简介

视神经是视网膜和大脑之间的联系纽带，由视网膜神经节细胞（RGC）轴突组成。这些轴突的跨度相对较大，其功能是维持视觉过程。在人类等哺乳动物中，视神经在受伤后的自我修复能力非常有限，往往会导致视力完全丧失。要改善这些患者的治疗效果，我们首先需要充分了解自然中物种再生所采用的机制。在青蛙身上，视神经受损后会自发地完全再生并恢复视力。这为我们提供了一个理想的模型系统，以了解成功的视神经再生所涉及的基本机制，并为最终在再生能力不足的物种中使用视力保护疗法确定目标途径。

视神经人工损伤模型面临的挑战

使用解剖显微镜手动操作蝌蚪视神经需要高超的显微外科技术，而且动物体型小且易碎，这对手术操作提出了挑战。即使使用微型机械手和精细镊子，人工横切也是一种侵入性操作，很难在不同操作者之间实现标准化，而且往往会导致很高的死亡率。病灶大小和位置可能会有很大差异，从而导致实验重复的不一致性。这些技术限制影响了模型的可重复性，降低了下游分析的统计能力。因此，特别是在需要精确控制视神经损伤的空间或时间的研究中，很难得出可靠的结论。

治疗视神经损伤的新型激光显微切割法

为了开发一种新的手术模型，LMD7与Xla.Tg（tubb2b：mapt-GFP^）Amaya 转基因 X. laevis品系一起用于可视化和进行视神经横断及随后的轴突再生。蝌蚪 的发育阶段为 43-46 期。在这些阶段，蝌蚪是透明的，可用于实时荧光成像。简言之，蝌蚪被麻醉后，被放置在由 4% 琼脂糖制成的特制手术床上，手术床位于腔室载玻片内。蝌蚪的朝向是背朝上平放。使用 Leica LMD7 软件中的 "测量 "工具，在放大 5 倍的情况下，用 349 nm 紫外激光切割器在视神经从球状体出口的远端约 300 μm 处横切每只蝌蚪的左侧视神经。用 "绘制 "工具在视神经上绘制的线接受四次激光脉冲（120 µJ/脉冲），激光功率为 55 mW（脉冲频率 = 2710），采用激光螺旋模式（步数 = 2，步长 = 5 μm，重复次数 = 2），以切割到适当深度并横切神经。荧光视神经显像中的缺口确认了切割。然后立即取出蝌蚪，在 1X MMR 培养基中复原，并用于随后的下游实验。

结果

这种激光显微切割方法可实现高通量、可重复和微创的视神经横切，从而在损伤后短时间内实现强大的视网膜神经节细胞（RGC）轴突再生。利用 LMD7 的精确性，可确保不同生物复制中病变位置的一致性，这对下游分析至关重要。该模型已被应用于通过纵向共焦成像研究轴突动态、绘制结构变性和再生（约14天）的时间表、研究细胞死亡和增殖、评估视觉通路恢复，以及通过RNA-seq描述早期转录组反应的特征。此外，该方案还与其他转基因蝌蚪品系兼容，如表达基因编码传感器的蝌蚪品系。例如，Xla.Tg (tubb2b:GCaMP6s^)NXR 株系被用来观察激光损伤开始时视神经中的钙动态。

结论

这种基于 LMD 激光的方法提供了所需的精确度，可产生一致的病变，同时将脱靶损伤降至最低，克服了人工技术的局限性。因此，它为研究中枢神经系统再生机制提供了一个功能强大且可重复的平台。该模型可用于未来的定向基因操作实验，从而扩展再生神经科学研究的工具包。