选择体视显微镜时的关键考量因素

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体视显微镜通常是实验室或生产现场“主力”。用户需要花费数小时通过目镜来检查、观察、记录或解剖样本。仔细评估哪些相关应用需要用到体视显微镜,是确保长期满意使用的关键所在。决策者们需要确保自己能够完全依照自己的需求来定制仪器。为帮助用户能更好的选择适合自己的体视镜,本文介绍了几个主要考虑的因素。

体视显微镜发展的历史

1890年左右,美国生物学家和动物学家Horatio S. Greenough提出了一种光学仪器的设计原理,至今仍被所有主要制造商所采用[1-3]。基于“Greenough原理”的体视显微镜可以提供高质量的真实立体图像。1950年代末,博士伦公司(Bausch & Lomb)推出了旗下一款带有格林诺夫设计的体式显微镜,其中有一项突破性创新:无级(变焦)变倍[3]。几乎所有现代体视显微镜的设计都是基于变焦系统。1957年,美国光学公司推出了一种立体显微镜,其光学原理基于望远镜或CMO(普通主接物镜)原理[3]。除了Greenough型外,这种体视显微镜由于其模块化和高性能而很快得到所有制造商青睐。

体视显微镜选择前需考虑的4个问题

体视显微镜可以说是一项高额投资,因此选择过程中应当审视夺度,认真思考。要将显微镜的用途和性能发挥到极致,用户应当考虑以下问题:

1.用途是什么?

  • 是否涉及筛查和分类?
  • 是否需要样本操作
  • 是否需要形成书面记录?

2. 需要观察、记录或可视化哪些结构?

  • 高分辨率是否比长工作距离或其他因素更重要?

3. 有多少不同的人员需要使用显微镜?他们在显微镜上的工作时长是多少?

  • 如果显微镜使用时间较长,请务必考虑人体工学性的配件,因为此类配件可防止出现重复性劳损。
  • 根据不同用户的人数,建议选用可以根据每个使用者偏好而进行调整的显微镜。

4. 购置显微镜的可用预算是多少?

  • 模块化解决方案看起来投资更高,但从长远来看,其多功能性、适应不同使用者的能力以及各种各样的插件和配件,从而节省更多成本。

选择显微镜时需考虑的5大关键因素

1. 变焦范围、放大倍数、视场和工作距离

  • 基本都在相同放大倍数下工作的使用者不需要太大的变焦范围。
  • 如果工作流程中要求进行搜索、查找和样本操作,就会需要从低到高可调节放大倍数的较大变焦范围。
  • 在相同放大倍数之下,可观看到的更大或更小的视场主要取决于目镜。更大的视场,可以让使用者更好的对样品进行定向观察。
  • 更大的工作距离意味着样本顶部和物镜前透镜之前的距离更大,因此在使用期间能够更加轻松地操作样本。

2. 景深和数值孔径(NA)

  • NA越高则分辨率越高,但景深通常会有减少。
  • FusionOptics技术结合高分辨率可获得更大的景深。

3. 光学质量

  • 平场光学件:校正整个物体视场上的图像平整度,适用于所有应用。
  • 消色差光学件:针对于色彩重现不是重点,而主要为了评估外形特征的应用。
  • 复消色差光学件:样品观察时,如果对颜色要求非常高,那就需要使用高质量的光学件以及适当的光源
  • 透过率:对于需要观察样本精密细节的应用需求,使用具有较佳透过效果的高质量光件会更突显优势性。对于要求较高的应用如研发用途,使用高透过率的光学件会有完全不同的效果
  • 色彩重现:如果看清样本真实颜色是个重要指标,则应当使用高质量的光学件和恰当的照明。

4. 人体工学设计

  • 人体工学配件能够让显微镜工作更加轻松并加快整个工作流程。例如,通过目镜观察样本时,变焦和对焦旋钮是否可以轻松调整?
  • 如果显微镜交由不同的用户操作,确保可以根据每个用户的偏好进行调整。

5. 照明

  • 最佳照明应当能够均匀照亮整个视场,带来理想的对比度并且准确揭示样本的真实颜色。

深度解释5大关键要素

1. 总放大倍数:物镜、变焦系数和目镜

体视显微镜的总放大倍数是物镜、变焦光学系统和目镜的合并的放大倍数[4]。

物镜拥有固定的放大倍数。仪器的变焦光学件允许在变焦系数范围内改变放大率。目镜也有固定的放大倍数。

为了求出通过目镜观察到的物体的放大倍数,必须将物镜、变焦光学系统和目镜的放大系数相乘。

总放大倍数的公式为:MTOT VIS = MO × z × ME,式中:

MTOT VIS 为总放大倍数(VIS代表“可视”);

MO 为物镜放大倍数(Greenough系统中为1x且没有补充透镜);

z 为变焦系数;

ME 是目镜的放大倍数。

一般来说,MO的数值介于0.32x和2x之间,z介于0.63x和16x之间,而ME则介于10x和40x之间。

放大倍数对视场的影响

观察目镜时会看到一个称为视场的圆形区域|4|。视场的直径取决于总放大倍数。例如,10x放大倍数的目镜视场直径为23。视场直径是指在物镜1x结合放大倍数与变焦光学之下通过目镜所观察到的视场为23 mm。

2. 景深:与放大倍数及分辨率的关系

景深由数值孔径、分辨率和放大倍数之间的关系来决定[5-7]。

为了获得样品最佳的观察效果,适当调整显微镜的设置可以在景深和分辨率之间获得最佳平衡。特别是在低倍率下,通过减小数值孔径,景深可以显著增加。因此,根据样品特征的大小和形状,找到分辨率和景深的最佳平衡是一个关键。

FusionOptics技术的高景深和高分辨率

体视显微镜能够同时获得高分辨率和高景深的精密光学方法可由徕卡显微系统得到了实现[8]。通过一条光路,观察者的一只眼睛可以看到高分辨率、低景深的物体图像。同时,通过另一条光路,另一只眼睛看到同一物体的低分辨率,高景深的图像。人脑将两幅独立的图像组合成一幅最佳的整体图像,具有高分辨率和高景深的特点。

3. 消色差或复消色差透镜的光学质量

色差是一种畸变,在这种畸变中,透镜无法将所有颜色聚焦到同一个汇聚点[2,9]。这是因为透镜对不同波长的光具有不同的折射率(透镜的色散)。当光线在远离球面透镜中心轴的点射入球面透镜表面时,其折射程度大于或小于射入靠近球面透镜中心点的光线时就会发生球差。好的光学设计的目的是减少或消除色差和球差。以下透镜可用于减少这些问题产生的影响:

消色差透镜

  • 校正了2个波长(红色和绿色)并让两者在同一平面上聚焦。
  • 可见光光谱范围内的标准应用。

复消色差透镜

  • 校正了3个波长(红、绿、蓝)并让三者在同一平面上聚焦。
  • 可见光光谱范围内最高级别的应用。

平面透镜

  • 未经平面校正的透镜在整个物体(视场)上显示出不均匀的焦点。
  • 建议用于需要观察较大视场的应用。

4. 工作距离会大幅影响显微镜使用性

工作距离是对焦时物镜前透镜和样品顶部之间的距离。一般来说,物镜的工作距离随着放大倍数的增加而减小。工作距离直接影响到体视显微镜的使用性,特别是用于检测和质量控制。

5. 为获得最佳结果的人体工学设计

一般来说,人的体型和工作习惯相当的重要。因此,对装备用于特定任务并搭配有特种配件和特定工作距离的显微镜,其高度(目镜)不一定适合于所有用户。如果观察高度太低,观察人员在工作时会被迫向前弯曲,导致颈部区域的肌肉紧张[10-12]。为补偿这些高度差,建议使用可变双目镜筒[10]。多亏了产品的模块化设计,CMO设计下的体视显微镜提供了许多可根据用户体型或工作习惯来定制仪器的方法,因此是首选的解决方案。

6. 正确照明让一切大为不同

对于体视显微镜,选择适合的照明是一大关键要素[13]。最适当的照明将有助于通过最优化的方式来对感兴趣的样本特征进行观察,同时有可能发现新的信息。对于所使用的显微镜和预期的应用,请务必确保良好的照明效果。

  • 反射照明

用于不透光、不透明的样本。根据样本的对比度和感兴趣的细节给出了不同的解决方案和样本的照明要求。参见以下参考文献13 了解体视显微镜入射照明的一些示例。

  • 透射照明

用于各种各样的透明样本,从生物样本如生物模型等到聚合物和玻璃。

  • 标准透射明场照明

用于所有类型的透明样本,带来较高的对比度和充分的颜色信息。

  • 倾斜透射照明

用于几乎透明和无色的样本;可获得更高的对比度和样本的视觉清晰度。

  • 暗场照明

用于观察样本平坦区域上的小特征,这些特征在明场中不易看到。如光泽或光亮样本上的裂纹、气孔、细小突起等。它还可以用来观察尺寸低于分辨率极限的样本结构。

  • 用于清晰透明标片的对比法

Rottermann或浮雕对比度是一种先进的倾斜照明技术,可以将显示出随着亮度的不同折射率的变化。正面浮雕对比度结构会增强,而反面浮雕对比度结构会降低。正、反浮雕对比可以更容易区分细微结构,方便于从样本中获取最大量的信息。

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