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数码显微镜摄像头和图像分析的基础技术术语定义

Microscope equipped with a K7 color CMOS camera for life-science and industry imaging applications. Microscope_equipped_with_a_K7_color_CMOS.jpg

现今绝大多数显微镜都配置了摄像头。摄像头的特征通常决定了所采集到的图像是否能够揭示出研究人员希望观察到的现象。但深入到摄像头术语时,技术术语十分繁杂。我们汇总整理了最为重要的术语及其简明释意以便提供方向。这些术语按字母顺序排列。

有关数字摄像头技术基础原理的更多说明以及显微镜摄像头的工作方式等可在这篇《数字摄像头技术介绍》的文章中了解。

像素合并(Binning)

像素合并是一种提高相机帧速率和动态范围的技术,同时可通过牺牲分辨率来降低噪声。这种技术通常用于高速荧光延时实验。相邻像素的数据会组合在一起并作为超级像素来读取,而不是读取每一个独立像素的数据。所使用的像素合并数值通常在2x2和8x8之间。请务必注意,2x2的像素合并所生成的像素是原始像素大小的4倍。

像素合并效果取决于摄像头所用传感器类型,如下表所示。

 

速度

数据容量

分辨率

SNR

CCD

EMCCD

CMOS

sCMOS

 

       

位深

摄像头传感器的位深阐述的是摄像头将来自像素阵列的模拟信号转换成数字信号的能力,通过灰度级或灰度值来表征。这是模数转换器的一种特性。位深越大,可输出的灰度值就越多,图像中可复制的细节就越多。

亮度

亮度描述的是影响个人或传感器的相对强度。就数字图像而言,强度是基于整个传感器当中进行平均计算获得的。

颜色查询表(CLUT)

数字图像由单个像素的阵列组成。这些像素的颜色信息可保存成数字代码,每一种颜色作为一个不同的数值存储。

颜色查询表是一种索引工具,所保存的这些数值主要以 RGB色彩空间基础,常用于监视器的具象化表现。

针对具体应用来选择适当的颜色查询表取决于用户自己的判断和需求。但经验证明,特定颜色查询表对于某些特定应用尤为有效且实用。例如,CLUT“绿色”通常用于记录用Alexa 488、FITC或其他类似荧光染料标记的样本,这些荧光染料都在绿色光谱范围内发射。另一方面,CLUT“红色”则用于使用TRITC、Texas Red、Cy3或其他类似的荧光染料来进行染色的样本,可在红色光谱范围内发光。

“CMYK”是一份特殊的颜色查询表,主要处理CMYK色彩空间且通常用于印刷系统的色彩输出。

色彩空间(RGB、CMY、CMYK)

在每一种成像系统(如,显示器、打印输出等)当中,任何颜色描绘都基于单个基本颜色的组合。成像方法通过加色和减色混合来加以区分。例如,在黑色显示屏上必须发射某种类型的光才能产生既定颜色。在这种情况下,光的类型以红绿蓝(RGB)为基础。

如果全部三种颜色都照亮则会生成白色。如果这三种颜色都被关闭则会生成黑色。人眼及数码相机和显示器都适应了RGB模型。

另一方面,印刷机使用了减色混合,因为在类似纸张的材料表面上,光必须从白色基材(纸张)上反射。因此,印刷机需要计算必须添加哪种墨水才能与白色基板结合以产生给定颜色。在这种情况下,青色、品红和黄色(CMY)的组合(红、绿、蓝的互补色)是光谱中所有其他颜色的基础。在这个模型中,添加全部三种颜色会形成黑色,而缺少全部三种颜色则会变成白色。

注:实际中,黑色使用单独的印墨来进行印刷以避免彼此叠加使用太多的颜色并获得更加生动的黑色印染表现。有鉴于此,色彩空间又被称为CMYK,其中K代表轮廓版,这是一种特殊的黑色印刷设备。

反卷积

反积卷 是一种通过运用数学算法在显微镜图像当中将离焦信息重新分配到原点的一项技术。通过反卷积处理,用户能够在特定聚焦平面上获得更加锐利的照片,而且感兴趣结构的3D成象更趋于真实。

保持时间

在共焦显微镜技术当中允许激光束在既定时间内扫描特定区域(相当于图像的像素尺寸)。该时间就被称为保持时间。合理地说,延长保持时间有助于光漂白并对样本形成压力。

动态范围

显微镜摄像头的动态范围提供了传感器可以同时记录的最低和最高强度信号的信息。对于低动态范围传感器,强信号会使传感器饱和,而微弱信号会在传感器噪声中丢失。大动态范围对荧光成像尤为重要。

曝光时间

数字摄像头的曝光时间决定了摄像头芯片暴露接触样本光线的持续时间。根据光强度的不同,对于大多数成像应用来说,这个时间通常从数毫秒至数秒不等。

增益

数字摄像头将光子数据转换成数字数据。该过程中来自传感器的电子会经过预放大器。增益就是对图像传感器的信号实施放大处理。应当注意到,放大处理不仅会增强信号,同时也会让噪声一并增强。

伽马(校正)

人眼对光线的感知是非线性的。我们的眼睛无法感知到两个光子比单个光子的亮度高两倍;我们只能感知出两个光子比一个光子更亮一些。和人眼不同,数字摄像头对光的感知是线性的。两个光子的信号量就是一个光子的两倍。伽马值则可看作是人眼和数字摄像头之间的一种联系。

这可以用以下公式表示,其中Vout是输出(检测到的)亮度值,Vin是输入(实际)亮度值:

Vout = Vingamma

通过改变伽马值 – 即进行伽马校正处理 – 就可以借助线性记录相机拍摄的数字图像适应人眼的非线性感知。这种校正处理绝大多数摄像头芯片都可以实现。此外,数字成像软件通常也有自己的伽马校正选项。

光强

光强是对能量级别的描述。在光学领域,辐射强度用以描述物体在一定时间和区域内发射的光能的数量。

噪声

噪声是所有测量中固有的不良特性。噪声是科学成像中关注的主要问题之一,毕竟噪声会影响到人们对感兴趣的信号进行量化的能力。成像时需要考虑的最重要参数是信噪比,即图像中的噪声与要采集的信号量的比值。噪声可分为以下几类:

光学噪声:通常由高背景染色引起的有害光信号,导致样本制备不良或样本高自发荧光。

暗噪声:电子在传感器中的热迁移,与积分长度成正比。暗噪声可以通过冷却成像传感器或缩短曝光时间来克服。

读取噪声:电荷从摄像头传感器内读出时引发的一种电噪声源。要减少读取噪声,可以减慢传感器读出速度,即减少最大可实现的帧速,或者换为更先进的传感器类型,即EMCCD和sCMOS传感器。

光子散粒噪声:由光子撞击传感器的随机性质引起的任何光信号中固有的噪声。这只在非常弱光的应用中被关注。采集更多的信号可以减少散粒噪声对图像的影响。

改善信噪比的最简单方法是通过延长积分计算时间或者增加照明强度来收集更多信号。这些方法并不总是可行,此时就需要使用更低噪声的摄像头。

Nyquist定理

显微镜中的成像是指从样本信号到数字图像的采样处理过程。Nyquist定理描述了采样处理的重要法则。

原则上,重现精度会随着采样频率的提高而增加。

Nyquist定理当中指出,采样频率必须大于输入信号带宽的两倍才能根据采样数据重新建出原始输入。对于数字摄像头而言,这主要体现在像素大小上。为获得最佳结果,像素应该始终比您要解析的最小结构还要小三倍,或者换句话说,每个可解析单元最好包含至少3个像素。

像素

摄像头中的像素是传感器的基本感光单元。这适用于所有二维阵列传感器,包括CCD、EMCCD、CMOS和sCMOS的显微镜摄像头。传感器上的像素数是一个经常被引用的单位,即500万像素的相机有500万像素。像素数量经常与传感器的分辨率混淆,因为不同传感器类型的单个像素的大小可能会有很大的差异。

量子效率(QE)

传感器的量子效率指传感器的灵敏度。量子效率描述了给定波长之下光子击中传感器而转换成电子的百分比。QE曲线在不同波长之下存在差别。

RGB/灰度直方图

图像上的每个像素都有特定的灰度值。灰度值范围从纯黑色(0)到纯白色(8位色深为255,12位色深为4095等)。

直方图中显示了灰度值在感兴趣区域(ROI)内的分布,即各灰度值所确定的像素数量且结果用曲线表示。

在直方图的帮助下,如摄像头曝光时间等多种设置均可获得优化。X轴上灰度值的平滑分布表明摄像头的动态范围获得最佳利用。

线型曲线图(Line Profile)

该工具用于对感兴趣区域(ROI)沿着线性来测量灰度值,以图形方式将灰度值显示成曲线并对其开展统计处理。

堆栈曲线图(Stack Profile)

该工具用于对感兴趣区域的面积(ROI)沿着面来测量平均灰度值,以图形方式将灰度值显示成曲线并对其开展统计处理。

饱和度

数字摄像头的基础工作原理是光子击打光电二极管产生电子,然后对电子进行收集、移动并最终转换成数字信号。考虑到电子的转移,其存在着两处瓶颈(CCD摄像头):

  • 单个光电二极管的电荷容量(满并容量)
  • 摄像头芯片的最大电荷传输容量

如果超过其中任何一个,相机将无法处理额外的信息,从而导致数码图像中出现伪影(如散光)。

注:LAS(Leica套装应用软件)X软件当中的查询表(O&U)可帮助控制饱和度。

显微镜摄像头的传感器类型(CCD、EMCCD、CMOS、sCMOS)

CCD显微镜摄像头:基于充电耦合装置(CCD)传感器的显微镜摄像头主要应用于明场和基础的荧光成像技术。与其他数字摄像头传感器一样,其单个像素在光线照射下产生电荷,最终转化为数字信号。与CMOS类型传感器相比,只有单一输出节点会在CCD传感器当中用于数据收集。

EMCCD显微镜摄像头:简单来说,EMCCD(电子倍增电荷耦合器件)传感器是一种配备额外专用EM增益寄存器的CCD传感器。该寄存器安装于传感器和读出电子元件之间,负责信号放大。此外,EMCCD传感器还可以是背照式的传感器,一般峰值量子效率可超过90%。尤其是在极端低光照的应用当中,EMCCD摄像机的使用能够获得较大的收益。

CMOS显微镜摄像头:互补金属氧化物半导体CMOS相机最初用于手机和低端摄像头。随着这种技术的不断完善,CMOS显微镜摄像头变成了标准明场显微镜的主流成像设备。不同于CCD,CMOS摄像头特有像素内电子元件。由于传统CCD传感器只是用单一读取节点,因此相比之下CMOS数千个读出节点的工作原理更有助于节省时间。

sCMOS显微镜摄像头:科学CMOS摄像头 – 或sCMOS摄像头 – 从CMOS显微镜相机演变而来。专门适应满足科研需求的这类型传感器没有CMOS传感器中常见的缺点,如噪声水平偏高和均匀性不理想。其较快的帧速、较高的动态范围以及较低的噪声可完美支持高端荧光成像应用。

信噪比

信噪比(SNR)主要衡量图像的总体质量。SNR越高则图像质量越好。信号是指从感兴趣的物体发出的由传感器收集并转换成电信号的光子数,而这里的噪声是指光子对传感器影响的随机性。检测到的光子数的这种变化称为光子散粒噪声。其他噪声贡献包括探测器的暗电流噪声、模数转换器的读取噪声、样本背景、室内照明等。

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