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自适应反卷积与 Computational Clearing 结合的力量

技术简介

Mouse kidney section with Alexa Fluor™ 488 WGA, Alexa Fluor™ 568 Phalloidin, and DAPI. Sample is a FluoCells™ prepared slide #3 from Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. Images courtesy of Dr. Reyna Martinez – De Luna, Upstate Medical University, Department of Ophthalmology. The_Power_of_Pairing_Adaptive_Deconvolution_teaser.jpg

反卷积是一种计算方法,用于恢复被点扩散函数(PSF)和噪声源破坏的物体图像。在本技术简介中,您将了解徕卡显微系统提供的反卷积算法如何帮助您克服宽视场 (WF) 荧光显微镜中由于光的波动性和光学元件对光的衍射而造成的图像分辨率和对比度损失。探索由用户控制或自动反卷积的方法,查看并解析更多的结构细节。

导言

自 1595 年发明显微镜 [1]、19 世纪 50 年代发现荧光和首次描述光学显微镜观察染色样品[1]以来,宽场(WF)荧光显微镜已成为一种广泛使用的成像技术,使工程和科学学科受益匪浅。我们对科学的好奇不断推动着显微镜的发展,其目标是观察和解析更多的结构细节。然而,由于光的波动性和光学元件对光的衍射,图像分辨率受到被称为衍射极限的限制。在 宽场荧光显微镜中,拍摄图像的对比度和分辨率会因多种原因而降低,其中包括:从相邻平面收集的光线、散射光和相机传感器噪声,所有这些都会增加图像的朦胧/模糊(背景噪声)。图像分辨率和对比度的其他损失可能与系统的光学响应函数,或通常称为点扩散函数(PSF)有关。PSF 描述了理想化的点光源在探测器平面成像时的样子,它就像一个低通滤波器,滤除了图像中的高频信息(图 1)。
在数学上,图像形成 (i) 可以表示为观测物体 (o) 与添加了噪声(泊松和/或高斯 - ε)的 PSF (h) 之间的卷积 (*),如公式1

为了尽量减少 PSF 降低图像对比度和分辨率的影响,通常会使用反卷积等图像复原技术来恢复和增强图像中丢失的细节。

图 1:物体与系统光学响应(PSF)的卷积会产生模糊图像。原始图像(a)被高斯噪声(b)破坏,并与合成 PSF(二维高斯函数)卷积(c),得到(d)所示的模糊图像。(e)和(f)分别描述了卷积前和卷积后的频域图像。图像与 PSF 的卷积起到了低通滤波器的作用,去除了图像中的一些高空间频率内容(f - 红色箭头;与 e - 红色箭头比较)。图像在 Matlab 2020a (MathWorks, Natick MA)中生成,测试目标取自维基百科

什么是反卷积?

反卷积是一种用于恢复被 PSF 和噪声破坏的物体图像的计算方法。给定获取的图像 i、观测对象 o 和 PSF 信息(可通过理论或实验确定),可以通过反卷积过程还原公式 1中的观测对象。要进行反卷积,需要通过傅立叶变换将物体和 PSF 变换到频域,如公式 2 所示:

由于计算上的原因,反卷积在频域中进行,公式 1 可改写为公式 3 所示,并求解 O:

其中,F、F-1、O、H 和 £ 分别为傅里叶变换、反傅里叶变换、傅里叶变换观测对象、傅里叶变换 PSF(称为光传递函数;OTF)和傅里叶变换噪声。然而,当 H 接近零时(在 PSF 边缘),公式 3 中的最左项和噪声项都会变得越来越大,从而放大噪声并产生伪影。为了限制放大的噪声量,可以通过截断 PSF的方法,但这会导致图像细节丢失。

为解决上述图像复原问题,人们提出了多种反卷积算法 [2-8]。例如,基于贝叶斯迭代法的理查森-露西(RL)算法是利用泊松或高斯噪声处理方式描述的图像统计来制定的。对概率的负对数进行最小化 [2,3],泊松和高斯噪声处理的反卷积 RL 方程为公式 4:

泊松噪声处理 [2,3]

高斯噪声处理 [10] 。公式 4 中的 i 和 o 已在之前定义,h+ 是翻转的 PSF。然而,与公式 3 类似,RL 反卷积方法容易受到放大噪声的影响,导致反卷积被噪声所主导 [2,3],如图 2 所示。限制放大图像噪声的部分处理方法是提前终止收敛,或仔细选择一个 ok 值,并用低通滤波器(如高斯滤波器)对其进行预模糊处理 [2,3]。最近,人们提出了一些新的反卷积方法,这些方法使用正则化项,可以添加到算法中,对反卷积进行约束。这类正则化技术包括 Tikhonov-Miller、 Total-Variation和 Good 氏粗糙度等方法 [2,4-9]。这些正则化项的目的是对反卷积进行惩罚,以限制图像噪声和伪影的产生,从而达到保留图像细节的目的。

徕卡显微系统的方法

徕卡显微系统使用的方法是一种加速自适应的 RL 方法,该方法使用 Good 氏粗糙度进行正则化和约束 [11]。利用贝叶斯统计方法和高斯噪声处理,反卷积时需要最小化的函数是:

其中,γ 是正则化项,∇ 是微分算子,h 是吉布森-兰尼 PSF。在公式 5 中,正则化项 γ 取决于局部信噪比(SNR),是在整个图像上创建的自适应信噪比(x,y)系数的函数,如图 3 所示。同时,γ∫1[∇o]2 对反卷积起惩罚作用,正则化项与 SNR (x, y) 的非线性关系为:

SNRmax 是预先确定的最大信噪比值,γmax 是预先确定的最大正则化值。结果就是公式 5 中的自适应正则化,与信噪比较高的区域相比,信噪比较低的区域的反卷积会受到更大的惩罚。这样,整个图像的反卷积过程都得到了适当的正则化,避免了图像伪影和噪声放大。

使用徕卡显微系统提供的反卷积算法,用户可以定义反卷积的迭代次数,或使用默认选项让算法决定收敛的停止标准。后一种选项更省时,而且用户无需猜测反卷积的效果。与徕卡显微系统的 Instant Computational Clearing (ICC) 算法类似,所述自适应反卷积方法包含在所有THUNDER成像系统中,并完全集成到成像工作流程 [12]

THUNDER:ICC 和反卷积

宽场荧光图像的反卷积效果取决于多个因素,包括从相邻平面收集的光量、样品厚度、散射光的程度以及图像的信噪比。例如,在厚度较大的样本中,样本内部可能会发生明显的光散射,导致反卷积无法生成具有更高分辨率和对比度的复原图像。对于信噪比较高、背景噪声极小的样本,反卷积可能会产生过度处理的图像,导致图像特征之间出现不必要的尖锐边界转换。因此,成像工作流程必须能够适应不同厚度、不同信噪比的样品。

在之前的技术简介中,我们讨论了 徕卡显微系统的 ICC 算法,这是一种通过去除背景噪声来恢复图像对比度的方法。该算法通过最小化非二次成本函数来估计和减去图像中的背景噪声,从而提高对比度 [12]。为了解决前面提到的反卷积缺陷,徕卡公司推出了一种结合两种计算算法的工作流程,允许用户执行 ICC 或 ICC 与反卷积。对于后者,可根据样本厚度和信噪比在两种不同的处理模式之间选择配对,分别称为小体积和大体积 Computational Clearing(SVCC 和 LVCC)。

使用 SVCC 时,自适应反卷积在THUNDER ICC 之前进行。在 SVCC 中,理论的 PSF 被用于了解系统光学参数(显微镜物镜类型、发射波长、样品包埋介质等)的反卷积。选择使用 SVCC 对 "噪声 "图像尤为重要,图 4,因为在通过 ICC 自动去除不需要的背景之前,自适应反卷积将提高信噪比,如图 4C。在 LVCC 中,ICC 在反卷积之前进行,并使用受 ICC 参数影响的 PSF。LVCC 非常适合信噪比较高、背景噪声较多的样本,这在厚样本中很常见,图 5。通过在反卷积之前执行 ICC,空间特征的对比度得到增强(图 5C),从而可以通过反卷积对剩余信号进行更精确的处理。

对于 SVCC 和 LVCC,ICC 的强度是用户可调的。强度参数 (s) 可调节从图像 (I) 中减去估算的背景强度 (I-background) 大小,从而得到最终图像 (I'):

通过强度参数,SVCC 和 LVCC使用户可以根据样本特点对计算算法进行微调,从而对数据进行最佳处理。与 ICC 一样,SVCC 和 LVCC 都可以应用在图像采集过程中或采集之后,并始终保留原始数据。这意味着用户可以直接将原始数据与处理后的数据进行比较,以便进一步量化。量化主题将在下一期技术简报中讨论。

致谢

我们衷心感谢 Kai Walter(软件工程师)、Louise Bertrand(Widefield 产品性能经理)和 Jan Schumacher(高级工作流程专家)阅读本技术简介并提出意见。

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参考资料

  1. Heinrichs, A. (2009, October 1). (1858, 1871) First histological stain, Synthesis of fluorescein. Retrieved November 09, 2020
  2. Sibarita, J. (2005). Deconvolution Microscopy. Microscopy Techniques Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 95, 201-243. doi:10.1007/b102215
  3. Dey, N., Blanc-Féraud, L., Zimmer, C., Roux, P., Kam, Z., Olivo-Marin, J., Zerubia, J. (2004). 3D Microscopy Deconvolution using Richardson-Lucy Algorithm with Total Variation Regularization.
  4. Rodriguez, P.,. (2013). Total Variation Regularization Algorithms for Images Corrupted with Different Noise Models: A Review. Journal of Electrical and Computer Engineering. 2013. 10.1155/2013/217021.
  5. Tao, M., Yang, J. (2009). Alternating direction algorithms for total variation deconvolution in image reconstruction. Optimization Online.
  6. Roysam, B., Shrauner, J. A., Miller, M. I., (1988) Bayesian imaging using Good's roughness measure-implementation on a massively parallel processor, ICASSP-88., International Conference on Acoustics, Speech, and Signal Processing, New York, NY, USA, , pp. 932-935 vol.2, doi: 10.1109/ ICASSP.1988.196742.
  7. Verveer, P., Jovin , T., (1998) Image restoration based on Good’s roughness penalty with application to fluorescence microscopy, J. Opt. Soc. Am. A 15, 1077-1083
  8. Zhu, M., (2008). Fast Numerical Algorithms for Total Variation Based Image Restoration, [Unpublished Ph.D. dissertation] University of California, Los Angeles.
  9. Good, I., & Gaskins, R. (1971). Nonparametric Roughness Penalties for Probability Densities. Biometrika, 58(2), 255-277. doi:10.2307/2334515
  10. Oyamada, Y. (2011). Richardson-Lucy Algorithm with Gaussian noise.
  11. D. Zeische, F. and Walter, K., Leica Microsystems CMS GmbH, Deconvolution Apparatus and Method Using a Local Signal-to-Noise Ratio, Germany, 18194617.9, 14.09.2018.
  12. Felts, L., Kohli, V., Marr, J., Schumacher, J., Schlicker, O. (2020, October 01). An Introduction to Computational Clearing. Retrieved November 09, 2020

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