活细胞成像
活细胞成像在微观层面揭示了生物过程的信息。它要求将标本保存在接近生理的条件下。下一段介绍了部分条件。典型的样本包括细胞培养物、活组织、类器官或模式生物，通常使用荧光显微镜研究这类样本。为此需要转染细胞，从而产生表达荧光标记蛋白质的转基因体。此外，还可以使用活细胞染料。
挑战
环境条件：
为尽可能获得接近真实状态的实验结果，活细胞成像条件必须模拟生理环境。不同的生物体所需的生理条件也不同，包括温度、pH、氧气含量等。例如，哺乳动物细胞要求的温度是37°C左右，昆虫细胞的最佳温度是27°C，鱼为28°C，而裂殖酵母则为30°C左右。
在碳酸氢钠缓冲液的帮助下，细胞培养基内的pH值持续保持在7.0-7.4，这就要求培养箱环境中相应地存在二氧化碳。此外，培养箱的环境应该是水饱和的，这样就不会有培养基蒸发了。
体内不同组织和细胞类型的氧含量不同。有趣的是，目前细胞培养箱和活细胞成像并没有广泛考虑氧的问题。不理想的氧气水平会导致增殖率下降（高氧）或代谢率降低（低氧）(Hadanny, A.; Efrati, S.).
光保护是活细胞成像的另一个挑战，因为光照射可以影响活细胞本身以及荧光团。例如，强光可以导致DNA损伤或光漂白荧光团。
MICA的设计旨在应对所有这些挑战：
外壳本身就像一个培养箱。这意味着样本周围空间被加热到所需的温度（比室温高5°C，最高42°C），并平衡到所需的二氧化碳浓度和湿度。
如果需要的话，氧气浓度可以在一个额外的载物台顶部腔室中控制。所有的参数均可通过MICA LAS X软件控制。样本的曝光由OneTouch功能设置，并可通过“样本保护-图像质量”滑块进行调整，以平衡所需的信号量与保护活细胞和荧光团。
为了在最小的环境干扰下获取样本，在前门中隐藏有一个小的服务挡板。
光可能是有毒的
由于光是带入样本的能量，它可能有负面的影响。任何光都可能干扰细胞内的分子，例如紫外线可能伤害皮肤。此外，荧光团可能形成与分子相互作用的自由基。光的负面作用被称为光毒性。挑战在于能产生足够的信号来解答科学问题的足够光量与尽量减少光毒性的平衡。MICA通过提供一个工具来帮助用户在不需要了解技术背景的情况下精确地平衡这两件事——保护-质量滑块。只需点击一下，OneTouch将根据滑块上的选择设置所有的激发和检测参数。
细胞内的动态变化可能非常快。例如，携带细胞器或囊泡的分子速度可达几微米/秒（Alberts B.等人）。这影响了对图像采集的要求，特别是当需要对多个荧光团进行成像时。这里的问题是，生物不会暂停所有的荧光通道从而在相同的状态下进行采集，而是持续不断进行。在一个经典的基于荧光过滤器的系统中，通常最耗时的步骤是为不同的通道更换滤光片。这导致实验中两个荧光团在两个不同的时间点被监测，导致无法实现精确的时空相关性。
MICA FluoSync™技术使用户能够同时获得多达四个荧光通道。这意味着不同的囊泡、细胞骨架和运动蛋白可以以100%的时空相关性进行成像。此外，同步采集使成像时间点的节奏更快，因此，可以用更灵敏地记录快速的细胞运动。
在给定的时间范围内记录许多重复的情况
在一个实验中记录许多次重复可能是一个挑战。假设用户想每10分钟记录一次，那么在下一个周期开始之前，只能记录一定数量的位置。通常情况下，如果您想在同一位置记录多个标签，就会有更多限制，但MICA不存在这个问题。FluoSync™技术使用户能够以四倍的速度记录，因为它最多可以同时获取四个标签，从而为用户留下更多的时间来记录更多位置。用户不必再在标签数量和位置之间进行权衡。
寻找正确的位置进行成像
在样本的正确位置上寻找和设置实验是具有挑战性的。实验人员需要使用目镜了解样本的整体概况，并记住不同的位置。数字显微镜可以生成样本的预览，这可以提供一些帮助，但实验人员仍然需要指出图像中要进一步成像的位置。MICA的Navigator工具可简化这一过程。用户可以生成低放大倍数或高放大倍数的预览，轻松定位感兴趣的区域，这些感兴趣区域可以用工具直接在图像上标记出。通过这种方式，后续高分辨率的图像可以保存下来。
选择正确的活细胞成像物镜
由于活细胞成像通常是在水溶液中进行的，高倍率物镜使用水作为浸没介质，因为它与培养基介质的光学特性相匹配。将水放在物镜和样品之间是很麻烦的，而且会导致样本的焦点和位置的改变。此外，水蒸发得相当快，因此需要不断补充。MICA集反馈回路于一体，在水浸式物镜的整个使用过程中，首先建立并维持浸没状态。这种方法不需要手动操作，可以进行长期实验。
为进一步提高光学质量，一些物镜会通过校正环来补偿样本平板的厚度。校正环可手动、也可自动操作。MICA配置了自动校正环功能，可实现自动优化。
重复实验之间的可比性
科学实验的一个关键方面是，尽可能少的变更可变参数以实现对样品和结果影响的把控。这包括在所有的实验中应用同一套成像条件。一个方面是稳定的环境条件（温度、pH值和O2，也见上文）。另一个重要方面是相同的成像参数（激发和检测）。MICA默认在不同项目中保持成像参数不变，用户仅基于自己的需求进行调整。可根据参考图像恢复成像参数。在环境条件方面，MICA是一个培养箱。MICA条件稳定能允许MDCK囊肿连续生长3周（也见下文）。
斑马鱼
图像中的鱼（斑马鱼）是一个带有中胚层命运报告基因的转基因鱼（Tbxta：GFP）。在这个实验中，一个发育中的胚胎从球期到体期被成像。用Dextran-Alexa647标记间质。胚胎保持在28℃。
囊泡:
U2OS细胞同时用WGA-Alexa488和WGA-Alexa555进行染色。这两种染料都聚集在细胞的质膜和所有囊泡和内体上。荧光剂同时或序列成像以进行比较。环境被设定为37℃恒温和5%CO2，即生理pH水平。
对于高倍率成像，使用了带有自动加水功能的63x/1.20水镜。不需要人工操作。
斑马鱼:
图像中的鱼（斑马鱼）是一个带有中胚层命运报告基因的转基因鱼（Tbxta：GFP）。在这个实验中，一个发育中的胚胎从球期到体期被成像。用Dextran-Alexa647标记间质。胚胎保持在28℃。
囊肿:
a) 将稳定转染了EB1-GFP的MDCK细胞在基质Matrigel中培养，在ibidi µ-Slide 8 Well玻片上诱导囊肿生长。环境被设定为保持恒定的37℃，5%的二氧化碳和高湿度。
在第2天，细胞已经显示出三维聚团，并在基质Matrigel内高度流动。
在第9天，囊肿保持相对稳定的位置，用较高的放大率（63倍）进行成像并在稳定状态下和随着时间的推移（6天和6小时的时间间隔的GFP和IMC（明场成像的调制对比））。三维采集能获得囊肿的三维图像（418层，220.7纳米间距，总Z-Stack大小92.02微米）。在第9天，一些囊肿除了EB1-GFP之外，还被Mito-Blue、SiR-Actin和Tubulin-SPY555标记。
b) 5000个稳定地转染了EB1-GFP的MDCK细胞在U型孔板中生长。有趣的是，这些细胞在几天后也形成了囊状结构。其中一个囊状结构在共聚焦模式下被进一步研究，以进行三维重建。
结果
短期的快速事件实验
U2OS细胞用两种不同的荧光染料标记相同的结构，WGA-Alexa488和WGA-Alexa555，它们都与细胞膜结合。通过在MICA序列模式下获取两个通道的这个实验设置能够在获取WGA-Alexa488（绿色）和WGA-Alexa555（红色）之间引入一个人为的时间差。有了这种实验设置，两种不同的Alexa染料标记同样的膜结构，能够在最小时间差的两个时间点成像。你可以在两种方法的比较中看到，在同步扫描中所有的囊泡都是黄色的——即绿色和红色的混合物，而在序列扫描中一些快速移动的囊泡看起来是两种不同的结构——即一个绿色和一个红色的囊泡。
中期实验
斑马鱼是一种模式生物，经常用于发育研究。在这个例子中，我们感兴趣的是研究细胞在空间的协调性，而这种协调性受到周围组织的粘度的影响。在THUNDER模式下对两个通道进行了24小时的成像，并使用大容量成像解析（LVCC）以获得更多的细节。
Mica allowed the simultaneous imaging of GFP and RFP in widefield microscopy. The possibility to work with a filter free system speeds up the acquisition, avoiding the filter shift in between one channel and the other.
The video shows standard widefield image vs. THUNDER Instant Computational Clearing of a representative tile highlighting the increased contrast.
长期实验
MDCK细胞是极化的上皮细胞，如果在Matrigel这样的基质上培养，会成熟为所谓的囊肿。这些三维结构可用于研究发育过程和潜在的蛋白质运输机制。这里，细胞被稳定地转染了与GFP相连的微管结合蛋白，并在MICA中培养了3周。
在U型孔板中培养细胞也可形成囊状结构。本实验中，MDCK细胞从第1天开始在MICA上培养并在明场和宽场荧光模式下记录，以研究囊肿的形成。MICA培养箱的特性使细胞在发展成囊状结构的过程中保持良好的状态。
培养14天后，在低倍镜共聚焦模式对囊肿进行成像，以确定一个感兴趣的囊肿。96孔板的情况下筛选样本以寻找合适位置来做进一步研究可能是很麻烦的。Navigator工具在此帮助保持样本的预览，并轻松地导航到相关的感兴趣的区域。
