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采用单损耗激光的五色FLIM-STED显微镜

网络研讨会,内容涉及使用单一损耗激光和荧光寿命phasor分离技术的五色STED技术。

Five-color FLIM-STED  5-color_FLIM-STED.jpg

About the webinar

受激发射损耗 (STED)显微镜通过激发一个受衍射限制的体积,然后用STED激光器抑制其外部的荧光,实现超分辨率。

STED激光器和荧光基团的选择取决于后者的光谱特征。对于具有三个或更多目标的多色 STED 实验,可以使用多个耗尽激光器。然而,当一种染料的耗尽激光与另一种染料的激发光谱重叠时,这会引入耗尽激光未对准和漂白染料的可能性。

因此,单一耗尽波长更适合多色分析,但会限制可使用的光谱通道的数量。为了进一步提高可区分的荧光基团的数量,除了光谱信息外,还可以利用它们的荧光寿命。一个挑战是找到合适的荧光基团组合,因为荧光寿命信息通常不可用。

网络研讨会内容预览

学习要点

  • 在STED显微镜中使用单个STED激光器的优势
  • 使用单STED激光器进行五色FLIM-STED成像
  • 利用荧光寿命来扩展共聚焦和STED多色成像应用中可用荧光基团数量的可能性

What we cover

利用培养细胞、常见染色方案以及市售荧光基团和显微镜,我们发现通过基于phasor的荧光寿命成像显微镜 (FLIM)可分离出两个具有相似发射光谱但荧光寿命不同的荧光基团,从而增加STED或共聚焦显微镜中荧光基团的数量。在我们的多色FLIM-STED方法中,近红光通道激发波长594nm,发射波长600-630nm)和远红光通道 (激发波长633nm,发射波长641-680nm)中的两个荧光基团以及一个进一步红移荧光基团(激发波长670nm,发射波长701-750nm)均用单一激光 (775nm)进行激发。基于phasor图的分析提供了一种简单、快速的方法来可视化染色质量、荧光基团的寿命以及进行简单混合的工具。我们还提供证据表明,如果能够找到合适的荧光基团,使用单一损耗激光进行八色FLIM-STED是可行的,同时证实了荧光基团在不同的耦合分子中可能具有不同的寿命。

总的来说,这种方法将激光扫描显微镜中可区分的颜色数量增加了一倍。基于phasor的分析简化了整个程序,使得大量科学家在经过短Using cultured cells, common staining protocols期培训后就能使用。

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