全内反射荧光显微技术
该技术利用衰逝波而非弧光灯、LED 或激光的直接照明来激发荧光分子，从而实现对玻璃/水（或玻璃/样本）界面附近荧光分子的成像。当入射光在两种折射率不同的透明介质界面发生全反射时，即产生衰逝场。在生物学应用中，入射光通常为激光，界面则为盖玻片玻璃与盖玻片和贴壁细胞之间的一层水溶液薄膜。
由于衰逝波的能量随与界面距离的增加呈指数衰减，只有靠近盖玻片一定范围内的荧光团会被激发。这使得成像具有卓越的信噪比，因为细胞其他部分的荧光团几乎不被激发。此外，全内反射荧光显微镜（TIRF）能提供轴向分辨率低于 100 纳米的高清图像，从而可观察膜相关过程，如细胞粘附、激素结合、分子运输以及胞吐和胞吞作用（例如神经递质的释放与摄取）。
全内反射和衰逝波场
当光线遇到两种折射率不同的透明介质界面时，部分会发生衍射，部分会被反射。在特定入射角度（即临界角）下，光线将完全反射，这种现象称为全内反射。只有当光从折射率较高（n）的介质（如玻璃培养皿，n=1.52）传播至折射率较低的介质（如水溶液，n=1.33）时，才能观察到全内反射现象。根据斯涅尔定律，可计算出发生全内反射时的入射光临界角（Θ）：
当全内反射发生时，入射光的部分能量会转化为电磁场并穿过界面，形成源自界面的衰逝波。产生的衰逝波与入射光频率相同，其振幅随穿透深度呈指数衰减。因此，衰逝波中的荧光团并非通过与光子相互作用而被激发，而是通过与电磁场的相互作用。该电磁场的穿透深度通常在 60 至 100 纳米之间，但可达 200 纳米，具体取决于光的入射角、波长及两种介质（如盖玻片玻璃与样本）的折射率。增大入射角会减小穿透深度，而增加入射光波长则会增大穿透深度。界面后方介质（如样本）的折射率同样影响穿透深度——折射率越高，衰逝波的穿透深度越大。 还需指出的是，TIRF 显微镜采用高功率激光光源，其强度通常高于共聚焦系统所使用的激光，以形成具有足够能量的衰逝波。
TIRF 显微镜的物镜
光学中实现全内反射有两种方法：一种是基于棱镜的，另一种是基于物镜的。在基于棱镜的 TIRF 显微镜中，棱镜附着于盖玻片表面，将聚焦光束或激光导向盖玻片与介质界面。借助棱镜，入射光的角度被调节至临界角。
现代全内反射荧光（TIRF）显微镜系统通常采用物镜式设计。光源（多为激光）通过物镜引导至样本，该物镜同时负责收集发射的荧光信号。TIRF 显微镜物镜必须具有极高的数值孔径（NA）（>1.45 NA），以确保入射角大于临界角。物镜的 NA 值越高，由于光线入射角可更趋平缓，衰逝场的穿透深度就越浅。相较于棱镜型系统，物镜法操作更为便捷——样本易于接触，且激光入射角可轻松调节。用户通过将激光光斑置于物镜后焦平面的不同区域，即可选择激光入射角度，从而改变衰逝波的穿透深度。在棱镜式 TIRF 系统中，棱镜会严重限制样本接触空间，使得更换培养基、添加药物或进行生理测量等操作变得困难。
此外，在基于棱镜的系统中，激光的准直及不同入射角的使用更为复杂。更重要的是，物镜型系统克服了棱镜型全内反射荧光（TIRF）系统存在的激光安全隐患。棱镜系统中的激光需开放式导入棱镜，而物镜系统中的激光则直接耦合至显微镜内部，并以高度可控的方式从物镜出射。
生物实验中的全内反射现象
如上所述，TIRF 显微镜物镜具有高数值孔径（>1.45 NA），这只能通过使用浸油或其他专用液体浸没介质实现。在典型的生物实验配置中，用于产生隐失波的激光需穿过物镜、浸没介质和盖玻片，最终在盖玻片/水（如 Ringer's 溶液、PBS 或其他成像缓冲液）界面发生反射。为避免反射和偏折效应，浸没介质的折射率必须尽可能接近盖玻片（通常 n=1.52）。标准浸油的折射率在 20°C 时为 n=1.515–1.518。当然，浸没介质的折射率具有温度依赖性。由于许多实验（尤其是活细胞成像）在 37°C 下进行，浸没介质可能因温度变化而产生折射率改变。为校正这些变化，许多 TIRF 显微镜物镜配备了校正环。
在生物实验设置中，全反射发生的界面通常位于折射率 n=1.52 的玻璃盖玻片与盖玻片和细胞之间薄层水介质（n=1.33）的交界处。衰逝波随后穿透这层水介质薄膜，经过直径约 7.5 纳米的质膜，进入细胞质基质，其强度随着激光入射角决定的特定穿透深度逐渐衰减至零。在某些区域，细胞直接贴附于盖玻片，两者之间不存在水溶液（如细胞黏着斑处）。此时，盖玻片与细胞的界面即为全内反射的发生位置。由于细胞具有不同于水溶液（约 n=1.38）的折射率，当系统设置为盖玻片/水溶液界面时，这些区域可能不可见。根据斯涅尔定律，全反射临界角取决于介质的折射率，因此盖玻片/水溶液界面与盖玻片/细胞界面的临界角并不相同。 这个问题可以通过改变激光的入射角度来解决。
由于衰逝场的本质是指数衰减的，只有距离盖玻片/水溶液界面（或细胞本身）约 60-100 纳米（具体取决于设置）范围内的荧光团会被激发。这通常在 z 平面上提供了 60-100 纳米的轴向分辨率，使得能够观察位于或靠近质膜的荧光团，而不会被细胞其他部位的荧光团信号所淹没。衰逝场仅激发细胞“切片”中的荧光团这一特性，使得生成的图像具有极佳的信噪比，几乎不存在来自离焦平面的背景荧光。
