物镜标签

徕卡显微系统的物镜根据类型有不同的编码和标签。

编码和标签便于识别物镜,并切言简意赅地表示出物镜的主要光学性能和应用。

您可以找到有关光学系统分配的信息,例如表示无限校正光学系统的“HC”和“∞”。

关于其他说明,请参阅下文。

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徕卡HC光学系统

徕卡的 HC光学 系统(和谐光学系统)中的光学元件相互匹配,确保生成最佳图像,对各个光学部件的误差进行修正:物镜、目镜、镜筒透镜、摄像头和显示器连接接口。

在校正某些光学像差时,显微镜被视为一个整体系统。球面像差、彗差和轴向色差最好在它们产生的区域校正,即在特定的元件中校正。横向色差和象散最好在物镜、管状透镜和目镜中同步校正。

因此,通过校正的相互作用可以获得最佳的图像结果。

HC = HC 系统中包含物镜。

HCX = 物镜还与旧版的光学器件兼容(Delta 元件,1991-1997年)

HC 系统可确保:

  • 平衡的光学和机械配合尺寸,
  • 所有光学系统元件平衡配合,
  • 平衡、可靠的技术解决方案,
  • 先进的制造技术带来卓越的光学性能。

物镜的放大率

每个物镜都标有放大倍数,例如5x或100x。

然而,仅物镜的放大率并不能决定显微镜的总放大率。后者是物镜放大率乘以目镜放大率的结果(管状透镜1x)。

举例:

40倍物镜 x 10倍目镜 = 400倍总放大率

然而,应该注意的是,物镜放大率越高,可见物场越低。

数值孔径

物镜的数值孔径(NA或A)是光学图像的关键参数,决定了物镜的分辨率性能和图像的亮度。该值通过透镜的孔径角半数a的正弦和浸渍介质的折射率n定义。根据这个定义,数值孔径越大,焦斑越窄,因此分辨率越高。物镜标有放大倍数,后面是特定的NA值,例如10x/0.40或 63x/1.40。物镜的数值孔径可以通过使用可变光阑物镜来改变。

徕卡科学实验室文章中详细解释了术语“数值孔径”: “谨防‘空’放大”

可变光阑

使用可变光阑物镜可以改变物镜的数值孔径。这对宽视场显微镜特别有用。如果可变光阑关闭,数值孔径和分辨率会降低,但景深会增加。如果再次打开可变光阑,数值孔径增大,分辨率增大,但景深减小。通过缩小孔径,物镜也可以用作暗视场物镜。

可变光阑物镜标有数值孔径的调节范围,例如1.4–0.7。

图中显示了孔径、分辨率和景深之间的物理关系。小孔径产生较低的分辨率但景深大。大孔径意味着更好的分辨率,但景深却更小。

Linear correlation between aperture and resolution (green), respectively exponential correlation between aperture and depth of field (red)

校正环

当 样本和所有中间光学介质的折射率与物镜设计值匹配时 ,高分辨率物镜可达到最佳性能。盖玻片厚度和温度的变化以及不均匀的厚样本会导致折射率不匹配。这会导致点扩散函数变差、几何畸变和色差。这些效应会限制显微镜图像的穿透深度、对比度和强度。传统上,浸油的折射率接近标准冕牌玻璃。

油浸物镜是为这种油的折射率而设计的。靠近盖玻片工作或者将样本封闭在折射率接近浸油的介质中时,这类物镜是最佳选择。对于 折射率与此值不同的样本,可使用专用物镜 。最常见的是 水浸物镜和甘油浸渍物镜 。有关浸渍介质的详细说明,请参考 此处 。水和甘油浸渍物镜 对盖玻片的变化——这会引起介质厚度变化以及折射率不匹配——温度以及浸渍介质或样本本身的偏差非常敏感 。因此,NA较高的水和甘油浸渍物镜通过 校正环 来补偿这些差异。

校正环可轴向移动中间物镜组,可用于恢复最佳图像分辨率和亮度。由于手动调整校正环需要时间和经验,还可能会干扰样本,徕卡提供 带电动校正环的水浸物镜 。

CORR = 带校正环的物镜

超长工作距离

可观察的样本区域经常受到物镜与样本架、多孔板边缘或附加设备(例如用于电生理学或活体成像)碰撞的限制。具有超长自由工作距离的物镜可以不受限制地对这类样本的边缘成像。

通过多光子激发或在透明化处理的组织中进行深层组织成像时也需要自由工作距离很大的物镜来充分利用这些技术的光学优势。在这类应用中,工作距离大于1毫米的需求并不少见。然而,物镜的数值孔径仍应尽可能大,以提供有意义的高分辨率图像。

徕卡显微系统提供一系列用于干式或水浸样本的超长自由工作距离的物镜。超长工作距离的水浸物镜还可提供大视角和惰性陶瓷正面,导电性和导热性极低,适合电生理学研究。

L = 具有超长自由工作距离的物镜

超长自由工作距离的水浸物镜

HCX APO L 20x/1.0 W

HCX APO L 20x/1.0 W,带 M32 螺纹,适用于 徕卡 DM6 FS 和CFS,FWD:2 mm

HCX IRAPO L 25x/0.95 W

HCX IRAPO L 25x/0.95 W,带 M25 螺纹,适用于所有显微镜,FWD:2.5 mm

HCX APO L U-V-I 系列

HCX APO L U-V-I 系列,FWD:2.2 – 3.6 mm

后焦平面

徕卡显微系统的物镜由固定后焦平面定义(见图示)。

如果需要,物镜的后焦平面代码可作为选择匹配的物镜侧DIC棱镜的参考。这样做的好处是,一个DIC棱镜可以使用多个物镜。

A、B、C、D E = 物镜的后焦平面

匹配盖玻片

盖玻片是光路的重要组成部分,因此应满足与物镜相同的光学质量标准。只有使用正确的浸渍介质和盖玻片,高质量的物镜才能充分发挥其潜力。

干式、水浸和甘油浸渍物镜对盖玻片厚度的变化极其敏感。带有校正环的物镜可用于校正这些偏差。

带或不带盖玻片使用

0

不带盖玻片使用

0.17

用于0.17毫米盖玻片 (DIN/ISO)

1.8Q

用于加热台上的1.8毫米石英玻璃窗口

0-2

用于0 - 2毫米厚的盖玻片

可用的标准盖玻片厚度为:

1号

0.13mm-0.17mm

1.5号

0.16mm-0.19mm

1.5H 号

0.17mm +/-0.005mm

要获得最佳结果,盖玻片类型取决于浸渍介质和数值孔径(NA)。表1可作为一般规则。

盖玻片和浸液:

浸渍介质带或不带 盖玻片1.5 型盖玻片1.5 H 型盖玻片
空气NA < 0.30NA < 0.70NA > 0.70
NA < 0.60NA < 0.90NA > 0.90
G 型浸渍(甘油)NA < 0.80NA < 1.10NA > 1.10
N 型浸渍(油)NA < 0.90NA < 1.30
F 型浸渍(油NA < 0.90NA < 1.30NA > 1.30

表1:盖玻片和浸液

相衬方法

相衬方法能使肉眼不可见的相移显示出来,从而能够观察未染色的活体样本。

特别适合特定相衬方法的物镜上有相应的标记。

BD

用于明场/入射光暗场

PH

相差物镜

RC

反射对比物镜(仅与 DM R)

P,POL

低应变,用于定量偏振

/

不适用于入射光,荧光除外

LMC

调制对比物镜(仅适用于徕卡 DM IRB)

沉浸式媒体的目标

为了获得高分辨率,物镜的数值孔径(NA)需要大于1。还需要折射率大于1的浸渍介质,即空气以外的介质。常见的浸渍介质有油、水和甘油。物镜上标明了必须与该物镜一起使用的浸渍介质。

多种浸渍

适用于多种浸渍液体(即油、水和甘油)的物镜可与适用于各种样本的最佳浸渍介质一起使用。

多重浸渍物镜:

  • HC PL APO 10x/0.40 IMM CS
  • HC PL APO 20x/0.75 IMM CS2

DIN/ISO 标准浸渍油

W

GLYC

甘油

IMM

任何其他或一种以上的浸渍介质

折射率

物镜前透镜前面的所有光学相关元件(浸渍介质、盖玻片、样本)都会对图像质量产生重大影响。理想状态下,所有这些光学层的折射率都应与物镜设计的折射率相匹配。实际上,这几乎是不可能的,因为样本通常不均匀,盖玻片的厚度不够精确且图像采集过程中温度会发生变化。

在为特定应用选择物镜和浸渍介质时,必须牢记这些因素。

物镜的数值孔径越高,样本内部感兴趣的结构越深,样本和浸渍介质的折射率匹配就越重要。不同的折射率会导致球差和畸变。这会导致对比度和清晰度降低,使结构看起来被压缩或拉伸。

一些常用浸渍介质的折射率:

细胞培养

1.33 - 1.38

F 型油

1.52

甘油G 型徕卡浸液为 1.45 (21℃) - 1.46 (37℃)
硅油

1.41

1.33

100% PBS pH 8,9

1.34

Mowiol

1.46

加拿大树脂

1.52

CLARITY

1.45

BABB

1.54

盖玻片

1.52

徕卡 N 型和 F 型浸油的折射率为1.518(23℃和546纳米条件下),即与标准冕牌玻璃(n=1.518)相同。进行多色成像时,浸油的色散度也很重要。这通常称为阿贝数,应该与物镜设计的阿贝数相匹配,否则会出现色差。例如,徕卡 N 型浸油的阿贝数为42.1,而 F 型浸油的阿贝数为 46,非常适合荧光成像。N 型不适合荧光成像。

油浸物镜适用于与油的折射率相匹的样本,即通常观察封在树脂、加拿大香脂或甘油明胶中的固定样本,或者在盖玻片下的样本(小于几微米)。如果折射率不匹配,离盖玻片位置太远,图像亮度和分辨率会下降。

进行活细胞成像,即在含水样本中成像时,我们强烈建议使用水或甘油浸渍。

孔径非常高的油浸物镜只能在比较窄的温度区间内提供其全部光学性能,因为油浸的折射率在很大程度上取决于温度。自由工作距离越大,油层越厚,因此温度引起的像差对图像质量的影响越大。这种温度效应随自由工作距离线性变化,但取决于 NA 的四次方。

如果实验温度与室温不同,建议采用水浸法,因为水的折射率对温度的依赖性明显较小,而且许多水浸泡物镜都有校正环,因此可以补偿。

水浸物镜特别适合观察水介质中的活细胞,因为这种浸渍介质和样本的折射率比浸渍油等介质更匹配。然而,水在 37℃ 时会迅速蒸发。徕卡水镜自动加水装置在执行实验期间会自动加水,以提供稳定的水浸。

甘油

目前,大多数固定样本,如 培养细胞、厚样本的组织切片以及全胚胎,都封闭在 Mowiol、Vectashield 或类似的 含有水和甘油以及各种化学物质(如防变色和防腐物质)的混合物中。这些介质的折射率接近 80%/20% 甘油/水混合物的折射率(n=1.45)。甘油物镜非常适用于封闭在折射率接近 1.45–1.46 的任何介质中的样本。

徕卡甘油物镜配有一个校正环,用于根据封闭介质成分的变化或者盖玻片厚度或温度的变化来调整光学元件的折射率。第17号应用说明(2004年4月)非常详细地介绍了甘油物镜以及折射率不匹配的影响。

如下所述,大多数多浸渍 (IMM) 物镜可用于甘油以及水和油浸渍。

甘油浸泡

用于甘油浸渍的物镜:

  • HC PL APO 63x/1.30 GLYC CORR CS2
  • HC PL APO 40x/1.25 GLYC CORR CS2
  • HC PL APO 40x/1.25 GLYC motCORR CS2
  • HC PL APO 93x/1.30 GLYC motC STED W
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