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用激光显微切割改进 RNA 分析

大脑研究:单个神经元切除以改善 RNA 分析工作流程

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帕金森病是一种与大脑多巴胺释放神经元细胞死亡相关的进行性神经退行性疾病。疾病患者和健康个体之间多巴胺释放神经元基因表达差异允许定义靶基因。对于 RNA 分析,单细胞分辨率至关重要。分析混合多巴胺释放神经元和其他细胞会扭曲结果。可以通过激光显微切割(LMD)分离和分析组织中的单个多巴胺能神经元。由于不均匀的细胞群体而导致的误解被排除。

具有单细胞精度的 RNA 分析工作流程

徕卡显微系统公司生产的激光显微切割(LMD)系统可使您只对感兴趣的细胞进行精确切割,从而改进您的工作流程。一切都在可视控制之下,不会受到周围组织的污染。

RNA 分析工作流程 - 步骤

1.样品制备

通常,激光微取物通常使用特殊的基于膜的载玻片。 LMD 的样品制备简单明了,可以从传统的组织学制备中得到启发。 石蜡包埋使组织样品更易于切割成薄片。 或者,您可以利用冷冻切片来准备您的载玻片。 用于 RNA 分析的组织通常是快速冷冻的,例如,用液氮,然后进行冷冻切片。

徕卡显微镜可以为您提供适用于您的应用的 LMD 载玻片 。

2.固定和染色

甲醛紫染色常用于神经组织。它是一种碱性染色剂,结合到神经细胞质中的酸性分子,如富含 RNA 的核糖体。甲醛紫可以永久染色一个切片,适用于石蜡切片和冰冻切片以及随后的 RNA 制备。除了甲醛紫,还可以使用其他染色剂,如甲苯胺蓝。

3. 可视化和 ROI

徕卡 LMD 激光显微切割系统可以生成一个自动样品概览,帮助您轻松导航到感兴趣的区域(ROIs)。

您的 ROI,例如,多巴胺能神经元,可以通过 ADM 软件模块自动识别和标记,或者您可以手动应用形状。

4. 激光显微切割

接下来,通过视觉控制,定义的感兴趣区域将被激光精确切割,并通过重力直接收集。无接触切割有助于防止污染,例如 RNases。此外,您可以使用“移动和切割”工具在飞行中直接切割样本,而无需预定义形状。通过重力收集可让您使用标准、经济实惠的消耗品,如 PCR 管或 8 条管盖。收集可以直接进行到裂解缓冲液溶液或干燥空气中。

徕卡显微镜系统可以为您提供适合您需求的 LMD 系统。

5.RNA 提取

徕卡显微镜推荐高质量的 QIAGEN 试剂盒(RNeasy® Micro Kit)用于核酸制备。它们可以立即用于下游应用,如 PCR、测序、定量和实时 PCR,或者可以在-20°C 保存,直到需要时再使用。请参阅 www.qiagen.com 了解详情。

6.RNA 分析

RNA 分析经典地通过 qPCR 完成。特殊的 LMD 协议确保 RNA 质量 保持不变。微阵列或下一代测序(NGS)等技术也适用。由于 LMD 的切割精度,您将仅获得您感兴趣的细胞的结果。这种能力使您能够可靠地比较不同组织区域的基因表达结果。

典型的研究领域

  • 阿尔茨海默病
  • 发育生物学
  • 老化
  • 肿瘤组织突变分析
  • 其他疾病

参考文献

  1. Duda, J., Fauler, M., Gründemann, J., Liss, B. Cell-Specific RNA Quantification in Human SN DA Neurons from Heterogeneous Post-mortem Midbrain Samples by UV-Laser Microdissection and RT-qPCR, In: Murray, G. (eds) Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology, vol. 1723, (Humana Press, New York, NY, 2018), pp. 335-360, DOI: 10.1007/978-1-4939-7558-7_19.
  2. H.-J. Lee, M.P. Jedrychowski, A. Vinayagam, S.P. Gygi, L.C. Cantley, M.W. Kirschner, Proteomic and Metabolomic Characterization of a Mammalian Cellular Transition from Quiescence to Proliferation, Cell Reports (2017) vol. 20, pp. 721–736, DOI: 10.1016/j.celrep.2017.06.074.
  3. H. Green, X. Zhang, K. Tiklova, N. Volakakis, L. Brodin, L. Berg, P. Greengard, T. Perlmann, P. Svenningsson, Alterations of p11 in brain tissue and peripheral blood leukocytes in Parkinson’s disease, PNAS (2017) vol. 114, iss. 10, pp. 2735-2740, DOI: 10.1073/pnas.1621218114.
  4. N.J. Ortner, G. Bock, A. Dougalis, M. Kharitonova, J. Duda, S. Hess, P. Tuluc, T. Pomberger, N. Stefanova, F. Pitterl, T. Ciossek, H. Oberacher, H.J. Draheim, P. Kloppenburg, B. Liss, J. Striessnig, Lower Affinity of Isradipine for L-Type Ca2+ Channels during Substantia Nigra Dopamine Neuron-Like Activity: Implications for Neuroprotection in Parkinson's Disease, Journal of Neuroscience (2017) vol. 37, iss. 28, pp. 6761-6777, DOI: 10.1523/JNEUROSCI.2946-16.2017.
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