1.样品制备
通常,激光微取物通常使用特殊的基于膜的载玻片。 LMD 的样品制备简单明了,可以从传统的组织学制备中得到启发。 石蜡包埋使组织样品更易于切割成薄片。 或者,您可以利用冷冻切片来准备您的载玻片。 用于 RNA 分析的组织通常是快速冷冻的,例如,用液氮,然后进行冷冻切片。
徕卡显微镜可以为您提供适用于您的应用的 LMD 载玻片 。
2.固定和染色
甲醛紫染色常用于神经组织。它是一种碱性染色剂,结合到神经细胞质中的酸性分子,如富含 RNA 的核糖体。甲醛紫可以永久染色一个切片,适用于石蜡切片和冰冻切片以及随后的 RNA 制备。除了甲醛紫,还可以使用其他染色剂,如甲苯胺蓝。
3. 可视化和 ROI
徕卡 LMD 激光显微切割系统可以生成一个自动样品概览,帮助您轻松导航到感兴趣的区域(ROIs)。
您的 ROI,例如,多巴胺能神经元,可以通过 ADM 软件模块自动识别和标记,或者您可以手动应用形状。
4. 激光显微切割
接下来,通过视觉控制,定义的感兴趣区域将被激光精确切割,并通过重力直接收集。无接触切割有助于防止污染,例如 RNases。此外,您可以使用“移动和切割”工具在飞行中直接切割样本,而无需预定义形状。通过重力收集可让您使用标准、经济实惠的消耗品,如 PCR 管或 8 条管盖。收集可以直接进行到裂解缓冲液溶液或干燥空气中。
徕卡显微镜系统可以为您提供适合您需求的 LMD 系统。
5.RNA 提取
徕卡显微镜推荐高质量的 QIAGEN 试剂盒(RNeasy® Micro Kit)用于核酸制备。它们可以立即用于下游应用,如 PCR、测序、定量和实时 PCR,或者可以在-20°C 保存,直到需要时再使用。请参阅 www.qiagen.com 了解详情。
6.RNA 分析
RNA 分析经典地通过 qPCR 完成。特殊的 LMD 协议确保 RNA 质量 保持不变。微阵列或下一代测序(NGS)等技术也适用。由于 LMD 的切割精度,您将仅获得您感兴趣的细胞的结果。这种能力使您能够可靠地比较不同组织区域的基因表达结果。
参考文献
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