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内耳的发育与恢复

鸡胚中感觉毛细胞的再生

Chicken cochlea tissue imaged with a THUNDER Imager using large volume computational clearing. Courtesy of Dr. Amanda Janesick, California, USA. Chicken_cochlea_tissue_THUNDER_Imager_large_volume_computational_clearing.jpg

本文讨论如何对鸡胚的厚耳蜗组织进行清晰成像,以便研究内耳毛细胞的再生。感觉毛细胞对听力和平衡具有重要的作用,然而毛细胞的再生机制尚不为人所知。鸟类的听觉器官在听力损失后可以恢复,因此通常使用鸡耳组织来研究感觉毛细胞的再生。使用THUNDER Imager拍摄的组织2D及3D图像清晰显示了毛细胞,并用Computational Clearing消除了不清晰和离焦模糊。

简介

由于触发、维持以及终止内耳发育和再生的机制几乎是未知的,所以很多研究都致力于对其进行更深入的了解[1-3]。由于鸡的听力能在损伤后数周内自然恢复,30多年以来,鸡胚一直被用作模式生物来研究耳内的感觉毛细胞再生。这种现象不会发生在哺乳动物身上[1-3]。内耳感觉毛细胞对周围液体的流动很敏感,并在调节听力、平衡和头部旋转中起到机械敏感性的作用。因此,科学家们正在研究与感觉毛细胞再生有关的机制。

挑战

一般情况下,由于较厚样本固有的光散射会产生离焦模糊,因而厚的切片组织使用宽场荧光显微镜观察会面临很大的挑战。模糊信号可能会掩盖样本内部深处的目标结构。

方法

使用孵化7天的鸡耳蜗组织43 μm厚振动切片来观察内耳中的感觉毛细胞[2,3],DAPI标记细胞核(青色),肌球蛋白7a抗体标记感觉毛细胞(品红色),Sox2标记支持细胞(黄色)。使用THUNDER Imager Tissue、40x油镜(数值孔径1.3)对切片进行了2D拼图(10个视野,见图1)和3D层切(厚度43 μm,层数159,见图2)。3通道10个视野拼图用实时成像解析(ICC)进行处理[4,5],采集和处理时间不到一分钟。由于ICC是一种2D方法,且不需要z-stack,所以可应用于单平面拼图扫描。使用ICC(见图1)或大容量成像解析(LVCC)(见图2)清除了原始宽场图像中的模糊和背景[4,5],这使得它们非常适合观察内耳的单个感觉毛细胞(品红色)和支持细胞(黄色)。

结果

使用THUNDER Imager Tissue采集的鸡耳蜗组织切片的图像如图1和2所示。

 

结论

上述所示的结果证明,通过鸡耳蜗组织厚(43 μm振动)切片的THUNDER图像能够观察到内耳的单个感觉毛细胞和支持细胞。使用Instant Computational Clearing(ICC)可快速处理并生成清晰的2D拼图,而使用Large Volume Computational Clearing(LVCC)能够采集到清晰的3D图像。Computational clearing可用于清除图像中的不清晰和离焦模糊。

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