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CLEM:整合光学电子显微镜优势

使用高压冷冻技术的光电关联显微镜(科普)

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近年来,光学显微镜研究以活细胞成像为主导,而电子显微镜则被用于高分辨率研究。后来,人们逐渐有意将这两种技术结合起来。整合之后的成果叫做光电关联显微镜(CLEM)。电子显微镜提供的高分辨率使样本制备过程中的人工产物同样清晰可见。新版Leica EM ICE是一款带有快速传输系统的高压冷冻仪,允许光镜电镜相关实验,能够完好保存超微结构,避免出现此类人工产物。

20世纪90年代出现的绿色荧光蛋白(GFP)激发了人们此后对活细胞成像研究的浓厚兴趣。而显微镜上配备的更快捷、更灵敏的检测装置则让这种研究兴趣愈发浓厚。生命科学从这些活细胞成像研究中获取了大量的研究成果,很难想象要是没有这些用具,生命科学将走向何种地步。

电子显微镜领域并未完全紧跟光学显微镜掀起的研究热潮,但近年来有迹象表明光学显微镜的分辨率有时给人们解答科学疑问带来了局限性。因此,人们愈发有意开发能将绿色荧光蛋白的活细胞成像功能和电镜的高分辨率有效结合的新技术(见图1)。绿色荧光蛋白在电镜(电子显微镜)中并非直接可见,但可以通过抗体或光转化显现。但这类方法只能用于在室温下化学固定的样本。有明确记录表明这种做法会引入人工产物。这些人工产物在光镜(光学显微镜)下不可见,原因可能是缺少固定剂(实时),或者在研究固定样本时人工产物不在光镜的分辨率范围内。

然而人工产物在电镜下则显而易见,这种成像能力正是我们在研究超微结构时需要的高分辨率和精确细节。另外一种依靠物理固定的方法叫做冷冻固定。这种方法能更快固定细胞,并且和化学固定不同,这种方法并非选择性固定。高压冷冻(HPF)如今是冷冻固定细胞和组织最可靠的方法。将样本置于高压下(2,000bar),数毫秒后在样品上喷洒液氮。这样做能避免冰晶形成和扩散,并立即固定样本,形成厚度可达200至300微米保存完好的玻璃化样本。

具备高时间分辨率的高压冷冻技术

高压冷冻设备最初并非是为这些类型的实验设计的,主要的限制在于在光镜下研究样本、发现特殊的稀有现象并将样本转移到高压冷冻设备进行固定这一过程所需的时间。对一名老练的技术员来说,这一过程至少需要30秒以上。到那时,想要观察的结构可能早已发生变化或者消失(见图1)。

于是,徕卡显微系统联手来自英国布里斯托沃克大学医学院的Paul Verkade博士着手开发一种能够进行光镜/电镜关联实验,同时支持高压冷冻技术且时间分辨率少于5秒的仪器。这项开发成果便是Leica EM PACT2 /新版Leica EM ICE(见图2)。该仪器可自由移动,能移动到任何光学显微镜所在位置。RTS指的是快速传输系统该系统由快速样品托和传输系统本体组成,快速装载机用于装载样品(见图3),传输系统本体则固定在高压冷冻设备上。待快速样品托插入快速传输系统后,样本被自动围住,并沿轨道快速传送至内部进行冷冻。这个过程仅需2.4秒。这让科学家有足够时间将快速样品托从光学显微镜下取出并放入快速传输系统。这一动作可在1至1.5秒内轻松完成,继而将时间分辨率总体维持在4-5秒左右。然后便可对冷冻样品做电子显微镜观察处理。

冷冻替换标准

多数情况下,这一过程会涉及冷冻替换。冷冻替换是指清除样品中的冷冻水和丙酮等溶剂,然后在低温下进行树脂渗透和聚合。为此,徕卡显微系统近期推出了配备EM FSP的Leica EM AFS2,它能自动替换所有冷冻替代化学物,简化科学家的工作。图3是该实验示例。表皮生长因子(EGF)与量子点偶联。量子点能产生荧光且电子密度高,是光镜/电镜关联研究中非常好用的标记。表皮生长因子内化30分钟后出现在多泡体(MVB)中。多泡体以动态结构出现,具有许多延伸部分并随时间显现和消失(见图3c)。

当观察到另一延伸部分出现时,取走样本并立即进行冷冻。对该细胞进行追溯便可在高分辨率下看见感兴趣的结构,发现关联。总之,Leica EM PACT2或者新版Leica EM ICE搭配徕卡显微显微镜为生命科学家提供了优秀的解决方案,既丰富了他们的研究手段又有助于扩展他们的学识。

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